1. 引言
宫颈癌是我国女性常见的生殖道恶性肿瘤，发病率呈上升趋势。在肿瘤细胞中，一些HSP家族成员表达增强并参与肿瘤细胞的某些生物活动。因此，GRP78在宫颈癌的发生、发展中所起的作用日益受到学者的关注。本研究分析了GRP78在慢性宫颈炎、CIN组织、宫颈癌组织中的表达差异，并对GRP78在宫颈癌组织中是否存在表达及与宫颈癌患者的病理分型、临床分期和淋巴结转移等临床病理参数之间的关系进行分析。
2. 材料与方法
2.1. 临床资料
收集贵阳市妇幼保健院妇产科2010年1月至2013年12月期间宫颈组织标本共计175例，分别为：术中取出组织标本：宫颈癌组织标本89例，所有标本均经病理组织学证实为宫颈癌，患者在手术前均未接受放化疗，并同时采集宫颈癌相关的临床病理资料：患者年龄、临床分期、淋巴转移、宫颈癌(病理)分化程度及HPV亚型情况。行宫颈锥形切除术取出组织标本：1) 慢性宫颈炎组织标本45例，所有病例均诊断为宫颈炎，病理证实无瘤变的宫颈组织。2) 宫颈上皮内瘤变41例，所有病例均为病理证实宫颈上皮内瘤变1~2级。取出组织，每一标本分成两部分，一部分立即置于液氮中保存，用于RT-PCR检测；另一部分固定，用于石蜡切片包埋。本研究已经获得贵阳市妇幼保健院伦理委员会批准。
2.2. 方法
2.2.1. 免疫组化检测宫颈组织GRP78 蛋白表达检测
采用免疫组化Envision二步法染色切片经脱蜡、水化后，3%过氧化氢溶液阻断15 min。GRP78用鼠抗人GRP78单抗、阴性对照用1% PBS缓冲液作为一抗，一抗稀释倍数为1:100，4℃孵育过夜。苏木精复染后，DAB显色，梯度酒精脱水，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。
2.2.2. 实验结果判断
以福州迈新公司提供的阳性片为阳性对照，以PBS (0.01 mol/l，PH6.0)代替一抗作为阴性对照。免疫组化染色阳性表现为：细胞浆或细胞膜上出现黄色颗粒。参考Schindl等 [1] 报道的方法略作修改，阳性标记强度判定标准：随机取5个高倍镜(×200)视野下观察，每个视野观察200个细胞，进行评分：1分：阳性染色细胞数 ≤ 25%；2分：阳性染色细胞数占25%~49%；3分：阳性细胞数 ≥ 50%。根据染色强度评分：0分——无染色，1分——淡黄色，2分——黄色，3分——棕黄色。在正常宫颈、慢性宫颈炎及癌组织中阳性细胞数及染色强度得分相乘，根据所占百分比分为4个等级：0~1分为阴性(－)，2~3分为弱阳性(+)，4~6分及为阳性(++)，7~9分为强阳性(+++)。
2.2.3. RT-PCR分析GRP78的表达
按TRIzol试剂说明书常规提取总RNA，经紫外分光光度计定量，RNA浓度和纯度，逆转录合成cDNA。根据NCBI数据库Gene ID：3309发现GRP78的CDS区域，并结合NCBI中Primer-BLAST设计引物序列：F1:GTCCTATGTCGCCTTCACTCC；R1:AAATGTCTTTGTTTGCCCACC；β-actin：F1:GGCGACGAGGCCCAGA；R1:CGATTTCCCGCTCGGC。将反应体系置于PCR扩增仪上94℃预变性3 min，然后开始PCR循环：94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 45 min，共30个循环，最后1个循环72℃延长10 min。
2.2.4. 统计学方法
应用SPSS20.0软件包进行统计学分析，计数资料采用χ2检验、Fisher确切概率法计算。计量资料采用均数±标准差(
± s)表示，采用t检验、ANOVA或SNK-q检验，以P < 0.05认为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 宫颈组织中GRP78蛋白表达
用高倍镜观察全片，光镜下GRP78在细胞浆和细胞膜中表达，染色后出现黄色颗粒为阳性表达，其中分为淡黄色、黄色、棕黄色，细胞核中未着色。本实验中GRP78在慢性宫颈炎组织、CIN组织及研究组宫颈癌组织和均有不同程度的阳性表达。见图1及图2。GRP78在宫颈癌中阳性表达率(94.4%)高于慢性宫颈炎和CIN组织。GRP78在宫颈癌组与CIN组间的表达差异有统计学意义(χ2 = 31.76，P < 0.01)，宫颈癌组与慢性宫颈炎组间GRP78的表达差异有统计学意义(χ2 = 48.40，P < 0.01)，慢性宫颈炎组与CIN组间GRP78的表达差异无统计学意义(确切概率P = 0.206)。见表1。
Table 1. The comparison of the expression of GRP78 in chronic cervicitis, CIN and cervical cancer tissue
表1. GRP78在慢性宫颈炎组织、CIN组织和宫颈癌组织中的表达比较例(%)
*：宫颈癌与正常宫颈组织比较，P < 0.01；#：宫颈癌与慢性宫颈炎组比较，P < 0.01；**慢性宫颈炎组与正常宫颈组织比较，P > 0.05。
Figure 1. Positive expression of GRP78 in control group
图1. GRP78在对照组中的阳性表达
Figure 2. Positive expression of GRP78 in cervical cancer tissue
图2. GRP78在宫颈癌组织中的表达
3.2. 宫颈癌组织中GRP78的阳性表达与患者临床病理特征的关系
GRP78在19例高分化鳞癌中阳性表达率为89.5%，25例中分化鳞癌中阳性表达率为96%，45例低分化鳞癌中阳性表达率为95.55%，高分化鳞癌与中分化鳞癌间比较无明显差异(P > 0.05)。高分化鳞癌与低分化鳞癌间比较具有明显差异(P < 0.05)。中分化鳞癌与低分化鳞癌间比较无明显差异(P > 0.05)。GRP78在宫颈癌I期标本中阳性表达率为90%，宫颈癌II期标本中阳性表达率为96.6%，两者间比较具有明显差异(P < 0.05)。GRP78在无淋巴结转移标本中阳性表达率为91.89%，有淋巴结转移标本中阳性表达率为96.15%，两者间比较具有明显差异(P < 0.05)。见表2。
3.3. GRP78mRNA的表达水平与患者临床病理特征的关系
GRP78mRNA在高分化和中分化中表达无明显差异(P > 0.05)，在中分化与低分化中的表达无明显差异性(P > 0.05)，在宫颈癌低分化中相对表达明显高于高分化，具有明显差异性(P < 0.05)。GRP78mRNA在宫颈癌中表达水平与宫颈癌临床分期的关系：GRP78mRNA在宫颈癌II期标本中相对表达(85.86 ± 8.21)明显高于宫颈癌I期相对表达(81.47 ± 5.53)，具有显著差异(P < 0.01)。GRP78mRNA在宫颈癌中表达水平与宫颈癌淋巴转移的关系：GRP78mRNA在有淋巴结转移中的相对表达(85.92 ± 8.41)明显高于无淋巴结转移者(82.21 ± 5.95)，具有明显差异性(P < 0.05)。见图3。
Table 2. The relationship between the expression of GRP78 and the clinical features of cervical cancer
表2. GRP78蛋白在宫颈癌中的表达与宫颈癌临床病理特征的关系例(%)
*高分化与中分化比较P = 0.062；#高分化与低分化比较P = 0.012；**中分化与低分化比较P = 0.907。
Figure 3. The relationship of the level of GRP78 mRNA in cervical cancer tissue and the clinical features of cervical cancer
图3. GRP78mRNA在宫颈癌中的表达与宫颈癌临床病理特征的关系
3.4. GRP78蛋白的表达水平与HPV亚型的关系
GRP78蛋白在高危型HPV的宫颈鳞癌组织中的阳性表达率为73.08% (HPV16(+)：72.41%；HPV18(+)：62.5%；HPV16(+)、HPV18(+)：85.71%)。与高危型HPV的宫颈鳞癌组织中的阳性表达率相比较，低危型HPV宫颈鳞癌组织(阳性表达率为47.37%)及HPV(−)宫颈鳞癌组织(阳性表达率为38.89%)明显降低，具有明显差异性(P < 0.05)。见表3。
4. 讨论
肿瘤的发生、发展是多因素参与，多途径作用的过程，其发生机制尚不完全清楚。近期研究发现，GRP78与肿瘤的发生发展密切相关，在肝癌等多种恶性肿瘤中都显现高表达 [2]。在对乳腺癌、胃癌和前列腺癌 [3] 等病例研究中发现：GRP78高表达常与较晚的临床分期、较低的病理分级和不良的预后相伴随。由此可推论GRP78具有对抗肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤的增殖、复发、转移及耐药的作用 [4]。
Table 3. The expression of GRP78 in the cervical cancer with different HPV subtype
表3. GRP78 蛋白在不同HPV亚型宫颈癌组织中的表达例(%)
*高危与低危组比较P=0.007；**高危与阴性组比较P = 0.002。
本实验免疫组化结果显示：GRP78在宫颈癌中的阳性表达率显著高于在慢性宫颈炎和CIN组，差异具有统计学意义，而其在慢性宫颈炎组及CIN组间的表达比较，差异无统计学意义。RT-PCR结果显示：GRP78mRNA在宫颈癌中相对表达水平显著高于慢性宫颈炎和CIN组织，差异具有统计学意义。实验结果说明GRP78高表达于宫颈癌组织。此外，近年来研究发现，GRP78还高表达于其他肿瘤中：在泌尿系，PootrakuL等发现GRP78在前列腺癌标本中的表达明显高于癌旁组织 [5]。在消化系统中，张新晨等报道GRP78在胃癌病人的表达水平高于正常胃组织 [6]。刘芳等报道在结肠癌组织中GRP78的表达高于结肠腺瘤，并且GRP78在结肠腺瘤中的表达水平高于正常结肠组织 [7]。在乳腺肿瘤中，Fernandez 等报道GRP78在恶性乳腺肿瘤中的表达明显升高，但在良性乳腺病变中表达则不明显 [8]。在对宫颈癌的研究中，荣小灵采用免疫组化及PCR方法检测报道：GRP78在宫颈癌中的阳性表达显著高于在宫颈炎中的表达 [9]。张晶采用免疫组化检测发现：宫颈鳞癌组GRP78阳性表达率高于其在宫颈上皮内瘤变和正常宫颈组织中的表达 [10]。由此说明GRP78具有辨别肿瘤组织与非肿瘤组织的特性 [11]。GRP78高表达于恶性肿瘤中，并且关于宫颈癌的两组报道与本研究结果有相同结论，均表明GRP78在宫颈癌中呈高表达趋势，而在宫颈非癌变组织中呈低表达。提示GRP78有可能成为宫颈癌生物学行为的一项标记物。
本研究收集宫颈癌患者临床资料，并结合其免疫组化及RT-PCR实验结果分析GRP78表达水平与患者临床病理特征的关系，结果显示：GRP78在宫颈癌II期标本中阳性表达率及GRP78mRNA的相对表达水平明显高于I期宫颈癌标本。说明GRP78在宫颈癌中表达水平随宫颈癌的临床分期较晚而上升。宫颈癌的临床分期是根据肿瘤侵润周围组织的范围而定义的 [12]。在宫颈癌向邻近组织及器官局部侵润、扩散、侵蚀这个逐渐蔓延的过程中，癌细胞不断地处于缺血、缺氧等微环境应激状态，触发UPR，在UPR中GRP78不断被诱导、合成、增加，以保护癌细胞继续生长、增殖 [13]。这与肿瘤形成后GRP78对肿瘤细胞进一步保护、促生长、促侵蚀机制是一致的。
其次，本研究中GRP78蛋白在低分化鳞癌中的阳性表达率明显高于高分化鳞癌。GRP78mRNA在低分化鳞癌中的相对表达水平明显高于高分化鳞癌。说明宫颈癌病理分化越低，GRP78表达水平越高。宫颈癌细胞病理分化越低，癌细胞侵袭力越强，预后越差，宫颈癌细胞分化和预后密切相关，而GRP78表达水平与细胞分化有关。由此可见GRP78的表达水平能反映宫颈癌的预后情况。
此外，本实验显示宫颈癌中GRP78蛋白在有淋巴结转移标本中阳性表达率高于无淋巴结转移标本。GRP78mRNA在有淋巴结转移中的相对表达明显高于无淋巴结转移者。实验结果说明GRP78蛋白和核酸在有淋巴结转移标本中明显高于无淋巴结转移者。提示GRP78在宫颈癌中表达水平随宫颈癌淋巴转移而增加。淋巴结转移是宫颈癌转移的主要途径，也是影响宫颈癌预后的最重要、独立因素 [14] ，早期宫颈癌5年生存率达80%~90%，但当有淋巴结转移时，宫颈癌5年生存率则明显下降至40%~50% [15]。因此，进一步说明GRP78表达水平可能作为宫颈癌预后评估的一项参考指标。
本研究进一步在此基础上进一步探讨，GRP78表达水平与患者HPV亚型的关系。GRP78蛋白在高危型HPV16(+)、HPV18(+)的宫颈鳞癌组织中的蛋白含量明显高于HPV(−)及低危HPV感染的宫颈癌组织。进一步证实了GRP78与HPV感染有相关性，提示内质网应激蛋白参与了宫颈癌的发生与发展。
5. 结论
综上所述：通过本研究发现与慢性宫颈炎、CIN相比，GRP78在宫颈癌呈高表达。提示GRP78有可能成为宫颈癌辅助诊断的一项标记物。GRP78的表达水平与宫颈癌临床分期、细胞分化、淋巴转移有关，与宫颈癌患者年龄无关。而宫颈癌临床分期、细胞分化、淋巴转移正是临床上评估宫颈癌预后的主要指标，患者年龄与宫颈癌预后无相关性。因此，GRP78可能成为宫颈癌病情发展、预后评估的一项参考指标。然而，本研究的样本规模有限，需要扩大样本量或多中心合作并长期研究，可以发现是否在临床工作中以GRP78作为宫颈癌辅助诊断及病情评估的标记物，可进一步提高宫颈癌体检普查及辅助诊断的准确性，为宫颈癌及时诊断、预后评估提供一项新标准及依据。
基金项目
贵阳市卫生局科学技术基金（筑卫科技第21号）;贵州省科技基金（黔科合J[2013]2020号）项目资助;贵州省科技基金（黔科合LH[2014]7297）项目资助。国家自然科学基金（81560287）。
NOTES
*通讯作者。