1. 引言
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌和结直肠癌，全球每年确诊53万例患者，其死亡率超过50%，而每年新发病例的80%集中于发展中国家 [1] 。我国的宫颈癌发病率居妇科恶性肿瘤之首，每年有13.5万人发病 [2] 。虽然宫颈癌的发生涉及诸多因素，其中持续性HPV-16高危型病毒感染已被公认为是引起宫颈癌以及发展成为浸润性宫颈癌的最重要因素 [3] 。
HPV-16型病毒的E6基因是重要致癌基因，大量宫颈癌病例研究结果表明，超过99%的宫颈癌样本中，病毒E6基因整合入宿主细胞并获得表达，导致正常细胞的周期失控进而发生癌变 [4] 。近年来，研究者关注到HPV-16型病毒E6基因的突变会造成HPV-16病毒致癌能力变化 [5] [6] [7] ，并且E6基因突变存在地理区域集中分布现象 [8] 。目前尚无镇江地区HPV-16型病毒E6基因研究报道。本研究分析了镇江地区HPV-16病毒E6基因变异情况和HPV-16病毒毒株亲缘关系，为HPV感染的治疗以及开发适合中国人群的宫颈癌疫苗提供流行病学资料。
2. 材料
2.1. 研究对象
样本取材于江苏省镇江市江苏大学附属医院进行HPV检测的妇女宫颈脱落细胞样本。实验对象的具体纳入标准及排除标准如下：
实验对象的纳入标准：
1) 检查者为女性；
2) 检查者为镇江籍，无外地长期居住史；
3) 检查者年龄大于25岁，小于60岁；
4) 检查者若为经期正常妇女，应在月经来潮后的10~18天为最佳检查时间；
5) 检查者三天内未作阴道冲洗，未使用避孕药膏等阴道内用药物；
6) 检查者24小时内未有性行为；
7) 检查者24小时内未使用醋酸或碘液涂抹阴道。
实验对象的排除标准：
1) 检查者非镇江籍；
2) 检查者曾有外地长期居住史；
3) 检查者年龄小于25岁，或者大于60岁；
4) 检查者正处于月经期，或者月经期前后三天；
5) 检查者三天内曾行阴道冲洗，或使用过避孕药膏等阴道内用药物；
6) 检查者24小时内有性行为；
7) 检查者24小时内使用过醋酸或碘液涂抹阴道。
2.2. 试剂和仪器
HPV分型检测试剂盒购自亚能生物技术(深圳)有限公司；2 × PCR Master Mix预混液购自美国Thermo公司；DNA Marker购自大连宝生物公司；PCR引物由苏州泓讯生物技术公司合成；分子杂交仪(YH-H16)购自深圳亚能生物技术有限公司；PCR扩增仪和凝胶电泳成像分析系统均购自美国Bio-Rad公司；水平电泳套件购自上海天能生物公司；低温高速离心机为美国Thermo公司产品。
3. 方法
3.1. 样本采集流程
将专用毛刷深入患者宫口处2 cm~3 cm 并顺时针旋转以获取足够上皮细胞，将取样后毛刷放入专用细胞保存液中，用于后续HPV-DNA检测。
3.2. HPV-DNA检测和分型
严格按照人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)说明书进行操作。该试剂盒用于体外定性检测宫颈脱落细胞样本中的人乳头瘤病毒(HPV) DNA，能够检测出23种HPV基因型，包括17种高危型：HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82；6种低危型：HPV6，11，42，43，81，83。具体方法如下：
1) HPV-DNA提取
充分洗脱宫颈刷上的样本，13,000 r/min离心10 min，弃去上清，保留管底的细胞块，加入裂解液50 μL悬浮沉淀，100℃水浴加热10 min，13,000 r/min离心10 min，保留上清待用。
2) PCR扩增
取出PCR反应管，分别加入已提取的待测样本DNA 5μl，反应总体系25 μl，最后加入1滴矿物油，每次试验设置一个阴性质控和一个阳性质控。PCR按以下条件进行扩增：50℃ 15 min；95℃ 10 min；94℃ 30 s；42℃ 90 s；72℃ 30 s；40 cycles；72℃ 5 min。
3) 杂交
首先将PCR扩增产物预变性，形成单链DNA，利用DNA双链碱基互补的原理，将PCR产物加入到固定有不同HPV亚型探针的低密度基因膜片上，共23种基因型，进行杂交。杂交后配制显色液显色。
4) 结果判读
HPV分型杂交膜上共有23种基因型，并设有生物素(Biotin)及内对照点质控点。两质控点阳性，其他点阴性，应判定为HPV分型检测结果为阴性。两质控点阳性，其他点有1个或1个以上HPV分型点为阳性，根据膜条HPV分型分布图判断阳性点，确定HPV病毒类型。选取其中35例HPV-16阳性标本用于后续研究。
3.3. E6基因扩增
根据HPV-16型病毒NC001526株设计E6特异性扩增引物，引物序列为E6-F: 5’-AACTAAGGGCGAACCGAAATC-3’和E6-R: 5’-CTCCTCCTCTGAGCTGTCATTT-3’。PCR反应体积为25 μL，其中宫颈脱落细胞DNA样本2 μL (<100 ng)，PCR反应上下游引物为0.5 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 60 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR反应产物以10 g/L浓度琼脂糖凝胶电泳检测结果。
3.4. E6基因分析
E6基因测序由苏州泓讯生物技术公司完成。凡发现突变的样品均经PCR重新扩增，并再次测序以排除PCR过程中碱基错配而可能产生的误差。对测序获得的E6基因序列与标准株基因序列进行比对。
3.5. E6基因进化树分析
将已测序获得的E6基因通过生物学在线软件BLAST进行比对，使用MEGA 5.0软件的邻接法(Neighbor-Joining, NJ)开展进化树分析。本研究所使用的HPV16型病毒E6基因的参比序列和登录号如下：
1) 非洲变异型：非洲1型(Africantype1)：AF472508；非洲2型(Africantype2)：AF472509；
2) 美洲变异型：亚洲美洲变异型(Asian-American)：AF402678；北美变异型(North-American)：U34116；
3) 亚洲变异型：东亚变异型(East Asian)：AF534061；中国甘肃(Gan Su)：EU918764；中国新疆(Xin Jiang)：FJ006723；泰国变异型(Thailand)：FJ610152；
4) 欧洲变异型：德国变异型(European German)：AF536179。
4. 结果
4.1. 镇江地区HPV-16型病毒感染情况
2017年6月至2018年5月期间，共检测样本650例，其中检出HPV病毒感染128例，HPV病毒感染率为19.7%。被检出的128例HPV病毒患者中，35例为HPV-16型病毒感染，感染率为27.3%。
HPV感染年龄分布，128例女性HPV感染在25~30岁、31~40岁、41~50岁、51~60岁年龄区间HPV的感染率分别为37.8%、35.4%、18.3%、8.5%。可见HPV感染高峰在25~40岁这个年龄段。但HPV感染者的年龄差异无显著性(P > 0.05)。提示女性生殖道HPV感染普遍存在于性活跃人群中。
4.2. HPV-16型病毒E6基因PCR扩增结果
35例HPV-16型病毒样本均可扩增出E6基因，产物大小为623 bp (见图1)。经BLAST比对确认为HPV-16型E6基因。
Figure 1. PCR electropherogram of HPV-16 E6 protein gene
图1. HPV16型E6蛋白基因PCR电泳图
4.3. HPV-16型病毒E6基因突变分析
本研究中HPV-16型病毒E6基因序列与标准株比较发现，20例样本第220位核苷酸发生从T到G的改变，其相应的编码氨基酸由天门冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Glu)，突变频率为57%，14例样本第178位核苷酸发生T到G的碱基突变，其相应的编码氨基酸由天门冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Glu)，突变频率为40%；8例样本第702位核苷酸发生从G到A的碱基突变，但相应编码氨基酸突变为同义突变，突变频率为23%；第135位核苷酸上共有6例样本发生碱基突变，总突变率约17%，其中3例样本发生从T到A的碱基突变，其相应的编码氨基酸由缬氨酸(Val)突变为天门冬氨酸(Asp)，另3例样本发生从T到C的碱基突变，其相应的编码氨基酸由缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala) (见表1)。
4.4. HPV-16型病毒E6基因核苷酸序列进化树分析
35例HPV-16型病毒E6基因与其他国内外HPV-16型病毒经Mega5.0软件分析，从进化树图可得出镇江地区HPV-16型病毒E6基因的进化树很明显与非洲变异株不在同一分支上，欧洲变异株与亚洲变异株遗传关系密切，另外新疆变异株与欧德变异株也在同一分支上，其遗传关系也非常密切。镇江地区分离HPV-16样本中，仅ZJ-25株与泰国变异株在同一分支，其它样本均与东亚变异株在同一分支，没有样本与非洲变异型(非洲1型，非洲2型)及亚洲美洲、北美洲变异体在同一分支。由此可得出，人乳头瘤病毒HPV-16型具有地域性分布(图2)。
5. 讨论
HPV的感染是导致宫颈癌发生的首要病因。在全世界范围内，最常见诱发宫颈癌发生的感染亚型为HPV-16。根据流行病学资料，相同HPV类型的不同突变株存在生物学差异，并且可能导致不同的致癌风险 [9] 。大量流行病学资料显示，HPV-16变异株具有不同的生物学活性和致癌潜能，其中某些位点(如L83V等)变异与宫颈癌的发生和发展密切相关 [10] [11] ，并且这些突变株的致癌能力具有地域性 [4] ，如欧美地区流行的HPV-16变异株主要是G350 (L83V)位点突变 [12] ，而东亚地区主要是G178 (D25E)位点突变 [13] 。
Table 1. HPV-16 E6 nucleotide mutation (only variable site listed)
表1. HPV-16 E6基因核苷酸变异位点(只列出有变异的位点)
Figure 2. Phylogenetic tree constructed from 623 bp fragment of 35 HPV-16 E6 variants
图2. HPV-16 E6变异型623 bp片段进化树
目前江苏省镇江地区HPV-16型病毒E6基因变异情况研究尚为空白。我们的研究结果表明，我市HPV-16型病毒E6基因最常见突变位点为第220位核苷酸，碱基由T突变为G，其编码氨基酸由天门冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Glu)；其次较常见突变位点为第178位核苷酸，发生T到G的碱基突变，其相应的编码氨基酸由天门冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Glu)；第702位核苷酸上的碱基突变为无义突变；第135位核苷酸有6例发生碱基突变，其中有3例发生从T到A的碱基突变，相应编码氨基酸由缬氨酸(Val)突变为天门冬氨酸(Asp)，另3例发生从T到C的碱基突变，其相应的编码氨基酸由缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)。综上所述，我市35株HPV-16型病毒E6基因中碱基错义突变频率为T220G (57%)，T178G (40%)，T135A (9%)，T135C (9%)；相应的氨基酸错义突变依次为：D39E (57%)，D25E (40%)，V11D (9%)，V11A (9%)。HPV-16型病毒E6蛋白的D25E变异是东亚人群中较常见的一种与病毒致癌能力相关的变异，是导致中国人和韩国人宫颈癌发生的高危因素 [14] [15] 。我们的研究发现，镇江地区HPV-16型病毒E6蛋白也存在较高的类似变异，该情况应该引起临床医生的高度重视。
宫颈癌的进展涉及多种因素，大多数HPV-16感染会在感染后一到两年内自动被免疫系统清除，只有一小部分HPV病毒感染发展成为宫颈癌 [9] 。根据致癌性HPV可分为高危型和低危型。常见高危型HPV有：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和73型等 [16] 。其中危险性最大的是HPV16型和HPV18型病毒，70%的宫颈癌由其引起 [17] 。常见低危型HPV有：6、11、42、43、44和54型等，常引起良性病变如尖锐湿疣等 [18] [19] 。HPV病毒基因组为双链环状DNA，长7.5 kb~8.0 kb。可分为三个功能区：1) 早期区(Early region E区)：分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等六个早期蛋白，这些蛋白在病毒DNA复制、转录和翻译调控等方面起重要作用；2) 晚期区(Later region L区)：编码主要外壳蛋白LI和次要外壳蛋白；3) 非编码区(Non-coding region)：含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控原件 [20] [21] 。其中HPV-16 E6基因是重要的病毒致瘤基因，使用细胞系模型和宫颈癌的实验数据表明，在超过99%的临床样品中，病毒的E6基因被保留和表达 [4] 。E6蛋白可结合泛素蛋白酶(E6AP)形成复合体，再与P53蛋白特异结合，使其降解，从而导致细胞周期失控。同时基于HPV-16 E6基因区域单核苷酸多态性(SNPs)系统发育模式，可将HPV-16定义为6个亚型：欧洲型(E)，亚洲型(As)，非洲1型(Af1)，非洲2型(Af2)，亚洲美洲型(AA)和北美型(NA) [21] 。HPV-16谱系有地理区域集中分布现象，存在民族性差异，并且与其他疾病也存在一定相关性 [8] 。其中E6基因序列变化(突变)使得HPV-16型中分支不同致癌能力也存在差异 [5] [6] [7] 。
本研究结果提示D25E和D39E两种变异是镇江地区HPV-16型病毒最主要的变异类型，该研究结果可以为未来HPV疫苗的进一步优化提供线索。在下一步研究中，我们拟进一步探讨镇江地区HPV-16型病毒E6蛋白D25E和D39E变异与宫颈癌发生的相关性以及致癌机制。
基金项目
国家寄生虫种质资源共享服务平台(平台-TDRC-22)；镇江市社会发展项目(SH2017024)。
NOTES
*通讯作者。