1. 引言
无花果(Ficus carica Linn.)属于桑科榕属无花果亚属，为落叶灌木或乔木，因无花果的小花隐藏在花托内，为隐头花序，只能看到花托形成的假果而看不到花，我们吃的是它膨大的花序轴，故称“无花果”。无花果具有很高的药用价值及营养价值，果、叶、根均可入药；无花果树枝繁叶茂，树态优雅，具有较好的观赏价值，是园林绿化、美化和盆栽观赏的优良花卉树种；是无公害绿色食品，栽培技术简便，适应性广 [1] [2] [3] [4] 。近年来随着生活水平的提高，人们越来越重视健康，无花果作为第三代保健型水果受到人们的青睐。
无花果的研究经历了从表型到分子层面的转变，分子标记技术近二、三十年来发展很快，主要有RFLP、RAPD、AFLP、CISH、SRAP、TRAP、ESTs、SNP、SSR。从染色体组型到SSR的过渡，目前SSR技术是最为常用的，成功的可能性最高的一种研究方法 [5] - [10] 。
无花果在新疆南疆地区种植分布零散，种植区域之间距离较远，本试验利用SSR分子标记技术，对南疆无花果资源进行DNA水平遗传多样性评估，能更好了解南疆蕴藏的无花果种质资源现状，为种质资源的有效保存和利用奠定理论基础。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
以从和田、阿图什、新和、喀什、阿拉尔等地采集的82份无花果种质的叶片为试验材料，采集地点及生境信息见表1，各材料的名称及来源情况见表2。
Table 1. Location and habitat information of fig germplasm
表1. 无花果采集地点和生境信息
Table 2. Name and source of test fig germplasm
表2. 试验种质名称及来源
2.2. DNA的提取
叶片DNA的提取分为研磨、裂解、萃取、沉淀、洗脱、干燥、溶解7个步骤，详细过程参考刘春艳等 [11] 的提取方法。
2.3. DNA的鉴定
核酸浓度用NanDrop2000 Spectrophotometer测定，根据A260/A280或 A260/A230值判断DNA纯度，DNA分子片段的长度及降解程度可通过0.8%琼脂糖凝胶电泳，电泳液为0.5 × TBE缓冲液进行检测，电泳结果在BIO-RAD ChemiDocTM XRS + 中观察照相。
2.4. PCR扩增反应与毛细管电泳
用8对引物对收集的82份材料进行分析，引物序列见表3。PCR体系由2.0 μL 10 × Buffer，0.4 μL 10 mmoldNTP，0.2 μL Primer-F，0.2 μL Primer-R，0.2 μL DNA聚合酶，5.0 μL模板DNA，7.0 μL ddH2O组成，总体系为15 μL。反应在C1000TMThermal Cycler中进行，PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃适温延伸40 s，34个循环，最后4℃保存 [11] 。DNA扩增片段通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，Bio-Rad ChemiDocTM XRS + 凝胶成像系统照相，选用Trans5K DNA Marker判断DNA扩增片段大小。
Table 3. Primer sequence and number of bases
表3. 引物序列及碱基数目
PCR扩增产物用NGS Fragment Analyzer™进行毛细管电泳法检测，毛细管电泳所用胶根据样品数而定，若是1F + 7GP模式，即插入染料体积为1.25 μL，分离胶的体积为25 ml，结果用其配备的PRO Size™分析软件进行分析 [12] 。
2.5. 遗传相似系数计算与绘制DUPGMA聚类图
根据引物扩增得到的SSR标记信息，转化为“01”矩阵，有带记为1，无带为0，利用NTsys 2.10e聚类分析软件进行遗传多样性分析，计算各材料间的相似系数，聚类分析按基于Nei-Li遗传相似系数按不加权成对数算术平均法(Unweighted pair group method with arithmetic，UPGMA)进行，绘制聚类图 [13] 。
3. 结果与分析
3.1. DNA样品的纯度与浓度分析
用NanDrop 2000 Spectrophotometer仪器测得样品DNA含量，A260表示核酸在波长为260 nm时的吸光值，A280是蛋白质和酚类物质在最高吸收波长280 nm处的吸光值，A230是碳水化合物最高吸收峰的吸光值，纯DNA的A260/A230值约为2.5，纯DNA的A260/A280比值约为2.0，均能满足SSR分子标记需要。
3.2. SSR标记结果与分析
从表4可知，82个无花果叶片材料经8对引物共检测到48个多态性条带，平均每个引物可检测到6个条带，每个材料平均可检测到0.6个标记；8对引物扩增的条带范围集中在110 bp~320 bp之间。
引物WHG-6在82个材料中扩增得到13个条带(见表5)，为最多，引物WHG-4和WHG-5只有2条带最少。以引物WHG-3为例，82个材料中扩增得到的5个条带大小在118 bp~132 bp之间，每个材料的扩增结果见表5。通过对比发现，同一种材料采用不同的引物进行扩增，得到的条带数不同，大小分布情况有所差异。
Table 4. Primers amplify information
表4. 引物扩增信息结果
Table 5. SSR fragment size distribution (Primer WHG-3 was taken as an example)
表5. SSR片段大小分布情况(引物WHG-3为例)
3.3. 遗传相似性分析
根据8对引物扩增得到的48个SSR标记信息，有SSR标记片段记为“1”，无记为“0”，得到01矩阵，利用NTsys 2.10e聚类分析软件计算出94份无花果材料的遗传相似性系数(表6)及绘制聚类图，最大值为1.00，最小值为0.048 (移栽1~2、移栽1~6与阿图什8之间)，平均为0.377。
Table 6. SSR markers for genetic similarity coefficient between 82 fig material (14 cases)
表6. SSR标记得到82个无花果材料间的部分遗传相似系数(其中14个为例)
3.4. 聚类分析
依据表6的相似性系数，利用UPGMA聚类分析结果见图1，由图看出，82份种质共计40类，供试材料在相似系数为0.42时分为六个类群。第I类群包含1、10、24、59、60、61、45、69、70、71、72、75、73、58、64、65共16个；第II类群包含21、30、31、33、50共5个；第III类群包含9、25、27、29、35、38、28、36、49、42、43、48、67、63、34共15个；第IV类群包含37、52、53、76、44共5个；第V类群包含2、3、4、5、6、7、11、12、14、15、16、17、18、19、20、32、13、40、41、51、57、66、74、77、79、80、81、56、78、82、55、54、39、68、62共35个；第VI类群包含8、26、47、22、23、46共6个。
从图1可知，来自喀什、和田、阿图什、新和及塔大的本地无花果材料，如喀什1~7号、塔大1~3号、和田无花果王、新和5号、和田2、10号聚为第V类，虽然聚居地不同，但仍聚为一类，说明聚居地对无花果的遗传改良作用不大。
Figure 1. UPGMA dendrogram based on SSR tag data
图1. 基于SSR标记数据绘制的UPGMA聚类图
新和采集的5份材料分布于I、III、V、VI类群，塔大移栽的28份无花果资源分布于I、III、IV、V类群，阿图什采集的无花果种质分布于I、II、III、V、VI类群，和田的10份无花果资源分布于I、II、III、IV、V、VI类群。可见，新和、阿图什、和田、塔大移栽的无花果类型丰富。
4. 结论与讨论
4.1. SSR标记对无花果资源多样性分析是可行的
82份种质共检测到48条多态性条带，每个引物平均得到6条带；82份所有种质的相似性系数在0.048~1.00，平均为0.377，遗传相似性低，遗传基础差异较大。
条带检测结果与引物，各种成分的组合比例，扩增程序的设定，操作过程有关。个别试验材料经毛细管电泳不能扩增得到多态性条带，82份种质共检测得到的条带为48条多态性条带，结果可能与引物有关，因所用引物只有8对，部分材料不能特异性结合产生特异性片段，且试验存在误差，操作过失，扩增过程中变性、复性、延伸的时间不恰当等、都会造成个别材料没有谱带。所提取的DNA纯度不高，可依次用酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇抽提，去除蛋白质，加入RNA酶去除RNA，以确保试验结果的精确性。
关于SSR分子标记技术在作物遗传育种中的应用罗冉 [14] 等作了详细的讲述，SSR所用DNA量少且质量要求低，即使是部分降解的样品也可进行分析；结合相关分析、聚类分析等数量遗传分析手段，可以对不同亲缘物种进行分类，判断其亲缘关系，评价不同品种的异质性并进而划分杂交优势群。胡杨、梁俊、昝逢刚已经在甘蔗种质上成功应用，本试验所用的方法借鉴了他们的方法，在此基础上作了适当的调整，利用其多态性丰富、提供遗传信息多、操作便利、在基因中分散分布等特点，根据聚合酶链式反应原理，对无花果的SSR-PCR反应体系各个成分的浓度、用量、组合效应及扩增程序等的优化成功得到清晰、准确的多态性标记，且降低试验成本，能更好地探索南疆无花果种质资源的遗传多样性规律，为进一步进行无花果的种间杂交提供基础。
4.2. 南疆无花果82份资源划分为6类，多样性丰富
将82份无花果供试材料经聚类分析在相似系数为0.42时划分为6大类；南疆蕴含的无花果种质资源丰富，阿图什、新和、和田等地种植的无花果类型多样，可为以后的进一步更深入研究提供基础 [14] 。
4.3. 南疆无花果资源遗传多样性来源于外地引种
研究结果显示来自和田、喀什、阿图什和新和的本地无花果聚为一类，遗传无差异，聚居地对遗传无影响，无花果以扦插、压条为主进行无性繁殖，出现遗传变异的几率低。阿图什、新和、和田等地的无花果种质资源中，除本地无花果以外，均为近5~6年从内地引进的，可见种质资源丰富源自于引种。
基金项目
新疆兵团博士资金专项《南疆无花果种质资源多样性研究》(2014BB013)；新疆第一师科技局项目《南疆无花果设施栽培技术体系的建立》(2016YY10)；大学生创新项目(国家级)《无花果扦插育苗体系的建立》(107572017057)。
NOTES
*通讯作者。