NAT  >> Vol. 9 No. 1 (February 2019)

    多肽类药物载体纳米羟基磷灰石的合成及应用研究
    Study on Application and Synthesis of Polypeptide Drug Carrier Nano-Hydroxyapatite

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作者:  

谭敏斯,姚 宁:广东药科大学药学院,广东 广州;
杨志杰:广东药科大学药学院,广东 广州;广东药科大学医药化工学院,广东 广州;
刘 意:广东药科大学药学院,广东 广州;广东药科大学医药化工学院,广东 广州;广东药科大学附属第一医院,广东 广州

关键词:
成核诱导剂水热法羟基磷灰石药物载体创口愈合Nucleation Inducer Hydrothermal Method Hydroxyapatite Drug Carrier Wound Healing

摘要:

以镁离子为成核诱导剂,采用水热法制备出颗粒均匀的近似球形的纳米羟基磷灰石(nHAP),并利用FTIR、SEM、TEM等手段对其进行表征。将nHAP作为多肽类药物载体,重点探讨了时间、温度、pH等条件对nHAP负载胰岛素的影响,制备负载胰岛素的纳米羟基磷灰石(INS-nHAP),并评价其释药性能。结果显示:当胰岛素浓度为1 mg/mL,吸附3 h,吸附体系温度为30℃,且pH = 3时,INS-nHAP中有效含量3.98%wt,包封率高达92.66%wt;前6 h内对应体外药物释放呈零级释放特征,累积释放率达到72.71%wt,约为55.58个单位的INS,接近人正常生理条件下的胰岛素分泌速率;以INS-HAP基础制备的海藻多糖凝胶贴具有明显的糖尿病创口愈合促进作用。

In this work, nano-hydroxyapatite (nHAP) particles, with uniform particle size and approximate spherical shape, were prepared by hydrothermal method using magnesium ion as nucleation in-ducer. nHAP was characterized by FTIR, SEM and TEM etc. The effects of insulin loading, such as loading time, loading temperature, pH of the solution for loading, and so on, were discussed. Insulin loaded nano-hydroxyapatite (INS-nHAP) was prepared. At the same time, release properties of INS-nHAP were evaluated. The results showed that the effective content of INS-nHAP was 3.98%wt, and the encapsulation efficiency was 92.66%wt when the concentration of insulin was used in 1 mg/mL, with pH = 3, 30˚C of the adsorption system temperature and 3 hours of the adsorption time. The cumulative release rate of INS-nHAP was 72.71%wt during the first six hours, which was about 55.58 units of INS, and was closed to the rate of insulin secretion under normal physiological conditions. The gel based on alginate polysaccharide and INS-HAP has obvious promotion effect on diabetic wound healing.

1. 前言

羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2, HAP)是人和动物骨骼、牙齿的主要无机成分,具有无毒、无刺激、无免疫原性、不致过敏反应、不致突变、不致溶血、不破坏生物组织的特性。纳米HAP已被广泛研究报道其是一种良好的药物缓释载体 [1] [2] [3] [4] [5] :杨辉等 [2] 以合成的多孔球形碳酸钙为模板,最终制得粒度均匀、分散良好、比表面积为16.07 m2/g的多孔微米级球状HAP,对于庆大霉素具有良好的负载性能和缓释作用;史振等 [3] 采用化学共沉淀法制备平均尺寸为183 nm的纳米羟基磷灰石,并以阿霉素为模板药研究其载药性能,包封率最大可达到11.75%wt;石景涛 [4] 采用沉淀法合成出多孔HAP微球,选择胰岛素作为负载对象,通过控制吸附温度、吸附时间、胰岛素浓度、pH值等条件最终获得了理想的载药率(3.2%wt)和包封率(92%wt)。

糖尿病人伤口愈合缓慢是糖尿病的一种常见并发症 [5] - [11] 。伤口处于持续的炎症状态,其中促炎性的巨噬细胞、细胞因子和蛋白酶不断积累,从而使其发生溃疡、感染甚至截肢。然而,目前临床上针对糖尿病人伤口愈合缓慢这一问题,解决方法仍仅停留在换药、控制血糖和控制感染等方面,且没有发现其它行之有效的方法 [6] [7] [8] 。胰岛素是临床治疗糖尿病的一线药物,其在伤口的愈合中发挥诸多作用 [5] [6] [7] :激活调节PI3K/Akt和MAPK/ERK两大创伤愈合通路;修复伤口处胰岛素信号转导缺陷;提高有关蛋白质的表达;加速新生细胞的再上皮化和肉芽组织的再生进而提高愈合质量等。胰岛素还可以通过调节氧化反应改善伤口状态,抑制活性氧物质的产生和其对伤口中蛋白质、脂类以及DNA的氧化损伤,并促进中性粒细胞在伤口中的早期募集。考虑到糖尿病创口特殊的生理环境,在局部强化使用胰岛素可能是一种行之有效的办法 [11] 。

本研究选用镁离子为成核诱导剂,采用水热法制备出颗粒均匀的球形纳米羟基磷灰石。选择胰岛素为模板药,探究影响HAP负载胰岛素(INS)主要因素,以及INS-HAP的释药性能,并考查对应凝胶制剂促创口愈合的效果,为糖尿病创口难愈合问题提供一种新的解决思路。

2. 实验部分

2.1. 仪器和药品

2.1.1. 主要仪器

透射电子显微镜(TEM),H-7650,日本日立公司;傅里叶变换红外光谱仪(FTIR),Affinity,日本岛津公司;紫外可见光光度计(UV),RF-5301,天美(中国)科学仪器有限公司;pH计,PB-10,赛多利斯科学仪器有限公司;高速离心机,JW-2017H,安徽嘉文仪器装备有限公司;集热式恒温加热磁力搅拌器,DF-101S,巩义予华仪器有限公司;箱式电阻炉,S-101,沈阳市节能电炉厂等。

2.1.2. 主要药品

主要实验药品有:磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、氯化镁、硝酸钙,分析纯,天津市大茂化学试剂厂;明胶、盐酸,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;磷酸二氢钾,分析纯,阿拉丁;牛胰岛素,生化制剂(≥27 u/mg),酷尔化学试剂。

2.2. 样品制备

2.2.1. 球形纳米羟基磷灰石(nHAP)的合成

溶液配制:称取1.321 g的(NH4)2HPO4溶于100 mL去离子水中,配置成0.1 mol/L的磷酸氢二胺溶液,标记为A液;同样称取12 g明胶溶于100 mL去离子水中,60℃下磁力搅拌溶解配成12%明胶溶液,标记为B液;称取3.542 g Ca(NO3)2∙4H2O和2.691 g MgCl2∙6H2O溶于150 mL去离子水中,配置成C液。

近似球形的nHAP的制备:量取10 mL A液置于50 mL聚四氟乙烯内衬中,在玻璃棒的搅拌下各添加11.5 mL B液,待A液与B液混合均匀后,搅拌下各加入16.7 mL C液。混合均匀后,用2 mol/L的硝酸水溶液调节体系的pH = 5.1。将内衬置于反应釜,在马弗炉中以1℃/min的温度上升至180℃,保持温度恒定,反应10 h后自然降温。

nHAP后处理:将制得的产物在4000 r/min下离心分离,去除上清液,将下层产物置于烧杯中,磁力搅拌均匀,加水量150 mL,离心去除上清液。重复上述操作6次,将洗涤后样品取出,在低于60℃烘箱中干燥得到土黄色粉末;再将粉末置于管式炉中在N2保护下560℃煅烧3 h (1℃/min上升),最终得到近似球形的nHAP。

2.2.2. 载药nHAP(INS-nHAP)的制备

实验组:取煅烧后的nHAP充分研磨;分别称取不同量的nHAP,加入10 mL的不同离心管中(对应编号为Ax);后各加入x mL pH = 3的盐酸溶液,调节体系的pH值,经超声分散10 min;后再向离心管中加入3 mL 0.86 mg/mL的胰岛素(INS)溶液,将这3支离心管分别放置在不同温度的水浴锅中保温若干小时,同时保持磁力搅拌,即实现INS吸附;随后在转速为6000 r/min下离心15 min,取其上清液并测定274 nm处吸光度,所得下层固体沉淀负载胰岛素的纳米羟基磷灰石(INS-nHAP),其对应编号为Bx。当nHAP用量为70 mg时,本研究系统还探讨了吸附时间、溶剂种类、体系pH值与温度等因素对于INS-nHAP的载药量及包封率的影响。背景组的制备是,nHAP添加量为0 mg,其他步骤跟实验组相同。

2.2.3. INS-nHAP释药特性评价

实验组:步骤2.2.2所得Bx在30℃的鼓风干燥箱中干燥后,分别取适量置于离心管中,并加入14 mL pH = 6.8的胰岛素PBS磷酸盐缓冲溶液;后将离心管分别放置在30℃水浴锅中保温,同时保持磁力搅拌;间隔1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后,以转速为6000 r/min离心15 min,取上清液2 mL,测定274 nm处吸光度。背景组制备方法同实验组。

2.3. 样品测试与表征

采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)等方法,确定样品的外观形貌、颗粒尺寸等信息(FTIR测试范围450~4000 cm−1;SEM样品先采用冷冻干燥,经喷金处理后在200 kV条件下观察;TEM样品负载于超薄碳网格上,在200 kV条件下观察)。采用紫外–可见分光光谱(UV)等方法,分析HAP载药、释药性能(UV测试范围190~500 nm,入射波长为274 nm)。

2.4. 分析方法的建立

标准曲线的建立

称取25 mg胰岛素于25 mL的容量瓶中,用0.01 mol/mL的盐酸溶液进行定容,配制成1 mg/mL的胰岛素溶液。分别取上述浓度的胰岛素溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5、4.0 mL于5 mL的容量瓶中定容,得到浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0 mg/mL的胰岛素溶液。在波长为274 nm处测定上述浓度的胰岛素溶液的吸光度。以胰岛素浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线见图1,该曲线方程:y = 0.93032x + 0.03184,R2 = 0.99942。

INS作为蛋白质在274 nm左右有紫外吸收,这是采用紫外分光光度法进行胰岛素含量检测的定量依据。通过检测离心后上清液的胰岛素浓度,计算出未被吸附的胰岛素的质量,再用总的胰岛素的质量减去上清液中胰岛素的质量即得胰岛素被吸附量 [12] [13] [14] [15] ,再通过下列公式计算有效含量和包封率。

= ( ) / 100 %

= ( ) / nHAP 1 00 %

Figure 1. Ultraviolet absorption spectrum and standard curve of insulin

图1. INS和nHAP的紫外吸收光谱及标准曲线

2.5. INS-nHAP基凝胶贴促创口愈合实验

大鼠模型的建立 [16] :将SPF级SD大鼠40只在标准实验室适应3天,于造模前12 h禁食、自由饮水。测空腹血糖和标准体重,造模时以新鲜配制的2%wt链脲佐菌素(STZ)柠檬酸钠水溶液(0.10 mol/L),pH = 4.5混悬液腹腔注射,第7天测空腹血糖大于11.0 mmol/L者,属成功复制模型。将成模大鼠按血糖随机分为两组,分别为模型组,药物组。大鼠用2%wt戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,背部剃毛4 × 4 cm2,局部碘酒常规消毒,酒精脱碘,用直径为1.5 cm的圆孔在鼠背上画圆圈,用手术剪沿圆圈的边缘剪下皮肤,深及筋膜层,止血后以消毒纱布包扎,自由饮水和喂食。3 d后溃疡创面有肉芽开始生长,溃疡模型制备成功。

创口愈合实验:INS-nHAP基海藻多糖凝胶(自制),实验前将此凝胶泡在溶解有/无特定浓度的胰岛素PBS缓冲溶液中,待其泡7 h后作为上述创口的敷料(备用)。各组大鼠溃疡创面覆盖相应的敷料,无菌包扎,每天换药1次。连续敷药7d。观察并记录创口愈合情况。

3. 实验结果与分析

3.1. 羟基磷灰石(HAP)的表征

3.1.1. 样品结构分析

图2(a)为560℃煅烧后nHAP样品的FTIR谱图。其中560 cm−1、602 cm−1对应 PO 4 3 的弯曲振动峰(ν4);1200~1000 cm−1处是 PO 4 3 的特征吸收峰,对应PO43-的非对称伸缩振动峰(ν3);963 cm−1处的吸收峰对应 PO 4 3 的对称伸缩振动(v1)吸收峰;3570 cm−1和632 cm−1处的吸收峰分别对应羟基(−OH)的伸缩振动峰(vρ)和摆动振动峰(vδ)。这些特征峰的存在证实HAP具有较强的极性,适当用作较强极性药物(如蛋白、多肽类等)的载体 [17] [18] [19] 。

3.1.2. 样品形貌分析

图2中的扫描电镜可知:经典水热法通常制备纳米级棒状的纳米羟基磷灰石(nHAP)如图2(b);当合成体系中添加镁离子作为成核诱导剂,有助于水热法合成近似球形的纳米羟基磷灰石如图2(c);且当镁离子浓度增加,可导致制备样品其颗粒更加均匀如图2(d),该样品的透射电镜可佐证这,其平均粒径小于50 nm如图2(e)。

Figure 2. FTIR spectrum(a) and SEM(b,c,d), TEM(e) images of nHAP

图2. nHAP的FTIR谱(a)、SEM(b,c,d)和TEM(e)照片

3.2. nHAP载药主要影响因素

3.2.1. nHAP用量对载药的影响

结合图3(a)、包封率及总载药量实验可知:当nHAP用量为70 mg时有效含量和包封率达到较理想的搭配,即包封率约76.92%wt,有效含量约3.30%wt;当nHAP用量为50 mg时,虽有效含量相对高,但包封率过低,会造成INS投料浪费;当nHAP用量为100 mg时,包封率高达92.20%wt,但载药量偏低,会导致临床使用剂量增加。对比石景涛 [4] 的结果,INS利用率相对更高。

3.2.2. 吸附时间对载药的影响

图3(b)可知:随着反应时间的增加包封率和有效含量也增加,且在3 h和4 h时有效含量、包封率基本一致,故可认为反应时间到达3 h时nHAP对INS的吸附已达到饱和状态。

3.2.3. 吸附温度对载药的影响

图3(c)可知:从20℃到30℃的范围内有效含量和包封率随温度上升而增大,但影响不是特别明显。当温度达到35℃时有效含量和包封率均出现下降,这可能是由于温度达到35℃对胰岛素有一定的破坏作用,使吸附量下降。因此,实验时选择30℃作为最佳吸附温度。

3.2.4. 吸附体系pH对载药的影响

图3(d)显示:加载INS时,体系的pH对INS包封率及有效INS含量有显著影响。随着pH的升高有效含量和包封率下降;pH = 6.2时有效含量和包封率最低,pH = 3时有效含量和包封率最高。根据HAP的吸附机理可能解释是:晶体表面上吸附胰岛素分子的点是由于OH的瞬间空缺而产生的,而随着pH值的升高,氢离子浓度升高,OH位置空缺的数目随之减少,因此吸附点的数目减少,导致胰岛素的吸附量

(a) (b) (c) (d) (e) (f)

Figure 3. Analysis of influencing factors of INS loading and drug release performance of INS-nHAP

图3. INS加载影响因素分析、INS-nHAP释药性能

减少 [5] [6] [7] 。pH = 2时的有效含量和包封率比pH = 3时小,原因是pH = 2时酸对羟基磷灰石的破坏较pH = 3时大。

3.2.5. 胰岛素溶剂对载药的影响

由3(e)可知:相同实验条件下0.01 mo/l盐酸作为胰岛素溶剂时胰岛素的吸附量比50%wt乙醇作为胰岛素溶剂的胰岛素吸附量大。低浓度的乙醇溶液可以作为胰岛素的溶剂,但是由于乙醇对蛋白类物质有一定程度的破环作用 [15] ,故不选择稀乙醇溶液作为胰岛素的溶剂。

3.3. INS-nHAP的释药性能评价

采用最优实验条件加载INS,所得INS-nHAP有效含量为3.97%wt,包封率为92.66%wt,其对应的释药性能如图3(f)所示,1小时内INS-nHAP能够释放出42.10%wt的胰岛素,约为32单位的INS。1小时后,药物每小时释放率逐渐减小,以每小时约7%的速率释放,每小时释放约5.4单位INS。6小时累积释放率达到72.71%wt,约为55.58个单位的INS。在基础状态下,人每小时约分泌0.5~1.0个单位胰岛素,每餐后胰岛素分泌升高5~10倍,人体每日的INS分泌量约为50单位 [17] 。应用于糖尿病人,在用药初期能够释放出足量的胰岛素,使血糖降低,在后期以缓慢的速率释放胰岛素,起到维持血糖平稳的作用,可见INS-nHAP具有较好的胰岛素缓释效果,使药物释放更接近正常人体生理。

3.4. INS-nHAP基凝胶促创口愈合效果评价

实验分别记录了贴敷凝胶0天、7天所对应的创口状态,如图4所示:相对于模型对照组而言,无负载INS的空白组的创口面积也一定程度的减小,表明本研究所用的空白凝胶贴具有一定的创口促愈合能力;载药组C伤口愈合效果进一步提高,说明海藻多糖凝胶基质与INS-nHAP对创口愈合具有协同作用,具体作用机制有待下一步深入探讨。

4. 结论

1、以镁离子为成核诱导剂,利于合成近似球形的纳米羟基磷灰石。

2、当nHAP煅烧温度为560℃,用量为70 mg,胰岛素浓度为0.86 mg/mL,吸附时间为3小时,吸附温度为30℃,反应体系pH = 3时,nHAP对胰岛素具有最优的有效含量(3.98%wt)和包封率(92.66%wt)。

Figure 4. Promoting effect of gel wound healing experiment for 7 days (A model control group, B blank group, C drug loading group)

图4. 凝胶贴7天内促创口愈合作用(A模型对照组,B空白组,C载药组)

3、体外药物释放实验表明,INS-nHAP在1小时内释放出32单位的INS;此后,每小时释放约5.4单位INS;6小时累积释放率达到72.71%wt,约为55.58个单位的INS,该释放特征接近人正常生理条件下的胰岛素分泌速率。

4、基于INS-nHAP的海藻多糖凝胶,7天内表现出明显的创口愈合促进作用。

基金项目

广东省科技计划项目(2016A010103039);广州市越秀区科技计划项目(2017-WS-016)。

参考文献

文章引用:
谭敏斯, 杨志杰, 姚宁, 刘意. 多肽类药物载体纳米羟基磷灰石的合成及应用研究[J]. 纳米技术, 2019, 9(1): 32-39. https://doi.org/10.12677/NAT.2019.91004

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