一种水体净化细菌的分离鉴定及生理特性分析
Separation and Identification of a Sort of Water Purification Bacteria and Analysis of Its Physiological Characteristics
DOI: 10.12677/AEP.2019.91012, PDF, HTML, XML, 下载: 768  浏览: 1,683 
作者: 曹 鎏, 赵 喆, 赵 斌, 黄俊坤, 杨书乾, 李诗香:东北大学秦皇岛分校,资源与材料学院,河北 秦皇岛
关键词: 分离氨氮生理生化实验水体净化Isolation Ammonia Nitrogen Physiological and Biochemical Experiment Water Purification
摘要: 从土壤中分离出一株能够去除水中氨氮的微生物,经过细菌菌落特征分析,显微镜染色实验,菌落呈圆形,乳白色,细胞呈短直杆状,严格好氧,为革兰氏阴性菌。通过接触酶实验、V-P实验、尿素分解等五项生理生化实验结果分析,对比伯杰氏手册,初步鉴定该细菌属假单胞菌属(Pseudomonas)。
Abstract: A microorganism capable of removing ammonia nitrogen from water was isolated from the soil. After the analysis of bacterial colony characteristics and microscopic staining experiments, the bacterial colony was round, milky white, and the cells were short and straight rod-shaped, strictly aerobic, which was gram-negative bacterium. Through the analysis of the results of five physio-logical and biochemical experiments, including enzyme exposure test, V-P test and urea decompo-sition test, the bacteria were preliminarily identified as pseudomonas by comparing the manual of Berger.
文章引用:曹鎏, 赵喆, 赵斌, 黄俊坤, 杨书乾, 李诗香. 一种水体净化细菌的分离鉴定及生理特性分析[J]. 环境保护前沿, 2019, 9(1): 75-78. https://doi.org/10.12677/AEP.2019.91012

1. 引言

随着国民生活质量的不断提高,生活污水和工业废水的排放量与日俱增,大量未经处理的污水直接排放,造成了严重的水质恶化,我国主要水系的水体都遭到不同程度的破坏 [1] [2] ;高浓度、难降解的有机废水成为了我国污水处理的主要难题。

微生物应用于水体净化首先源于美国学者Parker提出的“Probiotics”一词,通过向水体中定向投放微生物控制水体净化过程,逐渐发展出活性污泥法和生物膜法等微生物处理工艺;而我国于20世纪80年代开始研究微生物对水体净化的作用,目前水体净化细菌主要有硝化(反硝化)细菌、光合细菌、芽孢杆菌等三类;微生物脱氮、聚磷过程同步化进行已经成为国内外对于污水处理中优先解决的热点问题 [3] 。

近年来兴起的固定化微生物技术为有机废水的处理开拓了新的领域,应用微生物的生理代谢构建高效生化反应器,人为增强水体自净能力,符合环境保护要求,是污水处理的必然发展趋势,同时该技术还具有安全性高、成本低、可持续性强的优点 [4] 。

本实验于秦皇岛市海港区汤河沿岸表层土壤中分离出来的微生物就是一种优良的水体净化细菌,具有降解有机物、反硝化脱氮、聚磷等特性,可广泛应用在有机废水处理、特种废水处理等领域 [5] 。

2. 实验仪器及药品

2.1. 实验仪器

1) 手提式压力蒸汽灭菌锅:DSX-280B,上海申安医疗器械厂;

2) 生物显微镜:CX23LEDRFSIC,奥林巴斯(中国)有限公司;

3) 生化培养箱:HPS-400,哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

2.2. 实验药品

1) 分离培养基:蛋白胨1% (生物试剂,北京奥博星生物技术有限责任公司),牛肉膏0.3% (生化试剂,天津市凯通化学试剂有限公司),NaCl 0.5% (分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司) 0.5%,琼脂粉(生化试剂,天津市凯通化学试剂有限公司) 1.5%。

2) 革兰氏染色:结晶紫染色液(CM1001,北京路桥技术有限公司),革兰氏碘液(CM1001,北京路桥技术有限公司),95%乙醇(CM1001,北京路桥技术有限公司),沙皇复染液(CM1001,北京路桥技术有限公司)。

3) 淀粉培养基:蛋白胨1%,牛肉膏0.3%,NaCl 0.5%,琼脂1.5%,可溶性淀粉0.2% (分析纯,天津市北方天医化学试剂厂),碘液3%。

4) 甲基红培养基:蛋白胨1%,葡萄糖0.5%,K2HPO4 0.5% (分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司),甲基红试剂(分析纯)。

5) V-P培养基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,NaCl 0.5%,40%氢氧化钾溶液(分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司),5% α-萘酚酒精溶液(分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司)。

6) 尿素培养基:KH2PO4 0.14% (分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司),NaH2PO4 0.21% (分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司),MgSO4∙7H2O 0.02% (分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司),葡萄糖1%,尿素0.1% (分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司),琼脂1.5%。

7) 硫化氢培养基:蛋白胨10%,胱氨酸0.01% (生化试剂,天津市凯通化学试剂有限公司),硫酸钠0.01% (分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司),醋酸铅试纸(分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司)。

3. 实验步骤

3.1. 细菌的分离培养

从秦皇岛市海港区小汤河沿岸土壤表层处取得样品,通过样品风干、磨碎、过筛、混合后制成不同浓度梯度菌悬液,将菌悬液涂布到培养基中进行培养,多次划线分离得到纯菌落 [6] [7] 。

采用连续培养的方法进行培养,将培养基pH值调至7.0~7.5之间,放入高压蒸汽灭菌锅灭菌0.15 MP灭菌15 min,在无菌试验台进行接种,接种完成后放入恒温培养箱,控制培养温度25℃~30℃,pH值7.0~7.5之间,培养24 h [8] 。

3.2. 革兰氏染色

1) 固定:利用接种环将细菌接种在滴有无菌水的载玻片上,通过火焰3~4次使其固定;

2) 初染:滴加结晶紫液覆盖涂面,染色1 min后用缓慢水流冲洗,利用吸水纸吸去水分;

3) 媒染:滴加碘液覆盖涂面,染色1 min后进行水洗并吸去水分;

4) 脱色:滴加95%的酒精溶液三滴,并轻轻摇动进行脱色,脱色20 s后进行水洗并吸去水分;

5) 复染:滴加番红染液覆盖涂面,染色2 min后进行水洗并吸去水分;

6) 镜检:对染色后的载玻片进行显微镜观察。

3.3. 生理生化实验

3.3.1. 淀粉水解实验

将分离出的细菌接种到淀粉培养基上,调节pH值为7.2,控制恒温培养箱温度37℃培养36 h,培养完成后滴加少量碘液至培养基中。

3.3.2. 甲基红试验

将分离出的细菌接种到甲基红液体培养基中,调节pH值为7.0~7.2,控制恒温培养箱温度37℃培养24 h,沿管壁加入3~4滴甲基红试剂。

3.3.3. V-P实验

将分离出的细菌接种到V-P培养基中,控制恒温培养箱温度37℃培养24 h,依次加入40%氢氧化钾水溶液0.2 ml、5% α-萘酚酒精溶液0.2 ml,摇匀后置入培养箱中37℃恒温培养4 h。

3.3.4. 尿素分解实验

将分离出的细菌接种到尿素培养基中,控制恒温培养箱温度37℃培养72 h,每24 h观察一次微生物生长情况。

3.3.5. 硫化氢鉴定实验

将分离出的细菌接种到硫化氢鉴定培养基中,控制恒温培养箱温度30℃培养24 h,用无菌水润湿的醋酸铅试纸放在培养基中。

4. 实验结果与分析

菌悬液经稀释涂布平板后分离出12种菌落,通过平板划线获得目标菌落,菌落呈圆形,颜色为乳白色,不透明,正反面颜色一致,湿润,较为粘稠,与培养基结合松散,易被挑取,有臭味 [9] 。该细菌在显微镜下呈直或弯曲杆状,革兰氏阴性菌(–)溶解氧耐受程度强,革兰氏染色红色,接触酶阳性,耐酸程度差,温度超过40℃不能生长 [10] (表1)。

Table 1. Physiological and biochemical experiment results

表1. 生理生化实验结果

5. 结论

本实验通过对土壤中微生物进行采集、分离、纯化得到一种杆状细菌,经过对该细菌的生物学性质及生理特性分析,根据伯杰氏手册–常见细菌鉴定手册对该细菌进行鉴定,可确定该细菌属假单胞菌属下29种之一,具有分解有机物,降解有毒有害物质的特性,是一种优良的水体净化细菌;可广泛应用于固定化微生物技术,搭载载体进行有机废水的处理。

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