AMB  >> Vol. 8 No. 1 (March 2019)

    醛基化玻片固定里默氏杆菌观察生物膜
    Observation of Biofilm of RA by Immobilizing on Glutaraldehyde Treated Silicon Surface

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作者:  

蒋 姝:重庆轻工职业学院,重庆;重庆科技学院,重庆;
廖定容,王白雪,陈虹洁,郭艳婧,胡梦婷:重庆轻工职业学院,重庆;
黄承洪:重庆科技学院,重庆

关键词:
里默氏杆菌生物膜扫描电镜RA Biofilm SEM

摘要:

生物膜是里默氏杆菌(RA)的毒力因子早已被证实,但目前对于RA生物膜的形成机制还研究得不清楚,引起了很多研究者的兴趣。研究目的在于通过对硅基底表面醛基改性处理后固定RA,并研究烘干处理和喷金等处理,直接观察RA的生物膜结构。结果表明醛基化硅表面能有效地固定RA,经60℃烘干处理,喷金5秒可以清楚地观察到RA的生物膜结构,与常规的磷钨酸染色法相比具有耗时短、操作简便等优点,为生物膜进一步研究提供了新的方法学。

Biofilm from Riemerella anatipestifer (RA) is a kind of virulence factor that has already been confirmed. However, its formation mechanism and virulence contribution are still not well understood. The purpose of this study is to develop a simple and facile method for BF observation through surface aldehyde immobilization on the silicon substrate and direct investigation of BF microstructure by SEM technique with the help of heating and gold spraying. Results show that RA can be effectively fixed on aldehyde-treated silicon surface. BF microstructure can be clearly observed after 60˚C drying together with 5 seconds gold treatment. Compared with conventional ink staining and phosphotungstic acid staining, this method has the advantages of short time and easy-to-operation. It will provide a novel method for RA’s biofilm research.

1. 引言

里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)在我国广泛存在,且有多达21种血清型 [1]。里默氏菌没有鞭毛和纤毛等附属结构,有报道包括外膜蛋白和外毒素等具有毒力贡献 [2] [3] [4]。胡青海等 [5] 在2013年揭示了RA生物膜形成的规律,且证明它也是里默氏菌的毒力因子,这引起了很多研究者的兴趣 [6]。细菌生物膜的主要成份是多糖物质 [7],含水量高达90%以上,与染料的亲和力弱,塌陷或者皱缩产生形变 [8],通常将菌体和背景分别着色,把不透明的生物膜衬托出来以便于观察,但普通显微镜观察生物膜效果不理想 [9]。另一种方法是负染法再行电子显微镜观察,由于细菌带负电荷 [7],需要采用较强电子散射能力和易被生物吸附的试剂诸如钼酸铵、四氧化锇、磷钨酸等进行染色,经电子显微镜可以看到普通显微镜下无法看清楚的结构,但该方法需要制片、高锰酸钾氧化、水洗、草酸漂白、水洗、95%酒精分化、烘干、二甲苯固封等步骤,程序复杂,操作繁琐。本研究是在基底表面(玻璃或者硅片基底)进行化学改性处理,可以直接在基底表面固定RA,经适当条件优化可行SEM/TEM观察,具有耗时少、操作简单等优点。

2. 试剂和方法

2.1. 试剂

3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)购买自上海远幕生物公司;戊二醛购买自山西益鑫泰生物科技有限公司;其它试剂均属分析纯,购买自重庆川东化工有限公司;里默氏杆菌(RA)为本实验室分离保存;磷钨酸染色SEM观察在陆军军医大学电镜中心完成;醛基化表面固定SEM观察在重庆科技学院大型仪器共享中心完成。

2.2. 方法

2.2.1. 细菌的分离和纯化参照文献 [10] 的方法执行。

“在无菌条件下将病死鸭脑组织接种于巧克力营养琼脂平板,置蜡烛缸中37℃培养24 h,可疑菌落用巧克力琼脂平板纯化及扩大培养 [3]。”

2.2.2. 常规染色光学显微镜观察

细菌的生物膜观察经常性使用干墨水负染法染色,其程序为①加一滴60 g/l葡萄糖液于洁净载玻片的一端,然后挑取少量菌体与其混合,再加一环墨水,充分混匀;②另取一端边缘光滑的载玻片作推片,将一端边缘置于混合液前方,然后稍向后拉,当片与混合液接触后,轻轻左右移动,使之沿片接触的后缘散开,尔后以大约30˚角迅速将混合液推向玻片另一端,使混合液铺成薄层;③空气中自然干燥;④用甲醇浸没涂片固定1 min,弃去甲醇;⑤在酒精灯上方用文火干燥;⑥用甲基紫染1~2 min;⑦用自来水轻轻冲洗,自然干燥;⑧高倍镜或油镜检查。

2.2.3. 磷钨酸染色电子显微镜观察

样品制作程序为:①收集/离心菌体。②清洗菌体。③固定菌体。按常规方法脱水。2.5%戊二醛溶液固定2~4 h → 磷酸缓冲液清洗3次 → 1%锇酸4~6 h → 缓冲液清洗3次 → 乙醇梯度脱;④临界点干燥。⑤离子溅射金。⑥SEM观察。

2.2.4. 醛基化玻片固定电子显微镜观察

硅片在H2SO4/H2O2 (V/V = 3:1)中氧化30分钟,去离子水清洗3次,得到氧化硅片。在APTES/H2SO4 (V/V = 1:15)混合溶液中反应2小时,先用乙醇清洗3次,再用PBS清洗3次。硅片在戊二醛/PBS溶液中反应1.5小时后,先用PBS清洗,再用去离子水清洗3次,制成的玻片。然后稀释菌液,调整到1 × 105 CUF含量,滴加在玻片基底表面,自然阴干,放干燥箱烘干若干时间,制备好的样品经喷金处理直接观察。

3. 结果

3.1. 光学显微镜观察

图1可见,常规染色RA图像只能呈现黑色的模糊背影,菌体呈现较好的形态,但细菌产生生物膜的时间和厚度很不一样,还要视具体的染色操作技术的熟练程度而论。因此,此种方法的效果并不能很好地观察到RA的生物膜结构。

Figure 1. Optical observation of RA dyed by conventional method. 1000× amplification

图1. RA常规染色光镜图1000×

3.2. 磷钨酸染色SEM观察

实验中我们将细菌严格按照既定操作程序处理。如图2所示,RA在SEM图像中显示无菌毛和鞭毛等附属结构,菌体经放大15,000倍,大小2~3 × 3~5 um。从图中我们可以看到图像的背景,而RA轮廓清晰可见,这是由于染液中某些电子密度高的物质包埋低电子密度的样品,但仍然不能很好地呈现生物膜结构。利用扫描电镜可以对细菌的附属结构,例如菌毛、鞭毛等清晰观察,但电子显微重依赖电子的穿透作用,而生物样品一般导电性能差,因此成像效果较差。

Figure 2. SEM observation of RA dyed by phosphato-tungstic acid.15000× amplification

图2. RA的常规染色SEM图像15000×

3.3. 醛基化硅片SEM观察

RA在戊二醛表面直接固定,在SEM图像中呈现清晰的图像(图3)。为了获得更清晰的图像,我们对RA进行了喷金处理,如图3a为常规染色法获得的SEM图像,而图3b为经过优化后获得的SEM图像,可以看出,在菌体外围出现一层明显的透明圈,应该归于RA生物膜结构由于干燥或者喷金发生与菌体龟裂的结果。喷金可以明显提高样品的导电性,增强图像对比度和清晰度。研究发现,喷金时间对成像结果很重要。金膜太厚会掩盖样品的表面细节,太薄样品的导电性差,都会影响观察结果。研究证明结果表明,喷金5~20秒可以得到满意的效果。细菌表面有蛋白质和糖基等结构固定,可以通过不同的连接方法进行固定。不同修饰方法对于蛋白质的固定能力也不同。

Figure 3. SEM observation of RA directly treated by gold-spray and tethered on silicon substrate 20,000× amplification

图3. 对RA喷金处理得到的SEM图像20,000×

经过优化,我们发现以60℃加热30分钟,喷金5秒会获得满意的效果。值得注意的是,喷金过渡会使RA菌体龟裂,产生质壁分裂。SEM观察时,高对比度使图像富有立体感,但是对比度太高也会损失一些细微的结构。我们还意外地捕捉到RA赘生物在菌体侧壁和顶端分别出芽生长的情况,这为揭开RA分裂方式提供了有益的佐证。如图4所示,在RA的侧面和顶部分别捕捉到附着的赘生物。

4. 讨论

由于细菌菌体本身的生物属性及蛋白质、脂肪、糖等化学本质,以及荚膜并不依赖微生物的严格养分,即使添加更多的糖分对RA大罐发酵得到的菌体也是如此,细胞壁与细胞内容物之间并不能很好地进行区分,更不能把荚膜结构与细胞膜严格区分开来 [11]。荚膜主要与细菌的毒力与黏附性能等有关,胡青海等认为生物膜可能跟基因有关 [12]。因此,即使采用常规的经典的染色处理RA再行高分辨的SEM观察,也不能很好地观察到RA的荚膜结构。用磷钨酸染色,由于染色液的溶剂、离子组成、亲水性、

Figure 4. SEM of RA’s neoplasm tethered (a) on the side and (b) on the top (arrow noted)

图4. RA赘生物的SEM图像(a)侧面附着,(b)顶端附着

PH值等变化都有可能引起有缺陷的SEM图像。样品的亲水性也是容易引起负染色缺陷重要原因,当亲水性好的时候,负染色结果经常显示背景差,且样品浓度得不到真实显示。我们采用直接在醛基化硅片表面固定RA,经适当的加热和喷金处理,可以获得较清晰的RA菌体及其荚膜等附属结构的SEM图像。韦强等 [13] 2005年提取了RAⅡ赘生物,并得到有关RA赘生物的SEM图像。研究还获得了RA赘生物从不同的菌体部位释放SEM图像,这为揭开RA赘生物的毒力贡献具有方法学价值。

5. 结论

硅片表面经醛基化处理可以共价固定里默氏杆菌,在60℃烘干30分钟喷金5秒,可以直接用SEM观察到表面的生物膜结构,与常规染色与磷钨酸染色比较具有图像更清晰,耗时短,容易操作等特点,可以为RA研究提供新的方法学。

基金项目

研究得到重庆市科委民生项目(cstc2016shmszx0600)和工业发酵微生物重庆市重点实验室开放基金资助(LIFM201712),以及重庆市教委科技项目KJZD-K201806401和KJ1605701与KJ1505901资助。

文章引用:
蒋姝, 廖定容, 王白雪, 黄承洪, 陈虹洁, 郭艳婧, 胡梦婷. 醛基化玻片固定里默氏杆菌观察生物膜[J]. 微生物前沿, 2019, 8(1): 9-14. https://doi.org/10.12677/AMB.2019.81002

参考文献

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