AAC  >> Vol. 9 No. 2 (May 2019)

    聚β-环糊精修饰的玻碳电极对尿酸的测定研究
    Determination of Uric Acid by Poly-β-Cyclodextrin Modified Glassy Carbon Electrode

  • 全文下载: PDF(1574KB) HTML   XML   PP.71-78   DOI: 10.12677/AAC.2019.92010  
  • 下载量: 202  浏览量: 312  

作者:  

何亚媚,柯晓飞,吴 靓,冯九菊:浙江师范大学,化学与生命科学学院,浙江 金华

关键词:
聚β-环糊精玻碳电极尿酸选择性Poly-β-Cyclodextrin Glassy Carbon Electrode Uric Acid Selectivity

摘要:

采用循环伏安法(CV),将β-环糊精(β-CD)电聚合在玻碳电极(GCE)表面,制得聚β-CD修饰玻碳电极(pβ-CD/GCE)。基于β-环糊精和尿酸(UA)之间的主客体识别作用,pβ-CD/GCE能有效地富集UA。用方波伏安法(SWV)考察修饰电极对UA的氧化信号。结果表明,UA的氧化峰电流明显增强;UA和抗坏血酸(AA)的氧化峰电位分离,从而能排除高浓度AA的干扰,实现对UA高灵敏、高选择性测定。在优化的实验条件下,该传感器对UA的检测表现出了宽的线性范围(10 μM~500 μM)、低的检测下限(0.54 μM,3倍信噪比)、良好的选择性和重复性,并可用于实际尿样的检测中。

The Poly-β-cyclodextrin modified glassy carbon electrode (pβ-CD/GCE) was prepared by electro-polymerization of β-cyclodextrin (β-CD) on the surface of glassy carbon electrode (GCE) by cyclic voltammetry (CV). Based on the host-guest interaction between β-cyclodextrin and uric acid (UA), the pβ-CD/GCE could effectively enrich UA. The oxidation signal of UA at the modified electrode was determined by square wave voltammetry (SWV). The results showed that the oxidation peak current of UA was significantly enhanced; the oxidation peak potentials of UA and ascorbic acid (AA) were separated, demonstrating that the modified electrode could eliminate the interference of high concentration of AA, so as to realize the highly sensitive and selective determination of UA. Under the optimized experimental conditions, this sensor for UA showed wide linear range (10 μM - 500 μM), low detection limit (0.54 μM, S/N = 3), and good selectivity and repeatability, and was applied in urine samples.

1. 引言

人体内尿酸(UA)的生成和排泄不平衡时,会引起血液中UA含量异常,诱发多种疾病,例如痛风、高尿酸血症、白血病、莱纳综合征等 [1] [2] 。因此,无论是在临床诊断、还是在药物控制方面,发展简单有效的方法检测人体体液中的UA含量都有十分重要的意义 [3] 。UA具有电化学活性,可以用电化学方法检测,但在实际生物样品中常存在干扰物,如抗坏血酸(AA)等 [4] [5] [6] 。在常规电极(如玻碳电极)上,UA和AA的氧化峰电位相近,电化学信号会发生重叠 [7] [8] ;且生物样品中,AA的浓度较高,因此AA的电化学信号往往较强,会覆盖UA的信号,严重影响UA的测定 [9] 。所以,发展在高浓度AA条件下,选择性测定UA的电化学方法,更具实际意义。

β-环糊精(β-CD)是由若干D-吡喃葡萄糖基以α-1,4-糖苷键连接而成的环状低聚糖,其分子具有“内疏水、外亲水”的特殊结构 [10] 。β-CD有很强的分子识别和富集能力,其疏水内腔可嵌入多种无机、有机分子或无机离子等,从而形成主–客体包合物 [11] [12] [13] 。

基于此,本文采用简单的电化学聚合法,制备聚β-CD修饰玻碳电极(pβ-CD/GCE),作为传感平台。基于β-CD对UA的主客体识别作用,pβ-CD/GCE可以富集UA。相比于裸玻碳电极,该修饰电极检测到的UA的SWV氧化峰电流明显增加。此外,该电极还能有效地分离UA和AA的SWV氧化峰电位,从而实现在高浓度AA条件下,对UA的高灵敏、高选择性测定。

2. 实验部分

2.1. 仪器与试剂

CHI 650A电化学工作站(上海辰华仪器公司);BSA-224电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);KQ-5200超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。电化学研究过程采用三电极体系:工作电极为玻碳电极(GCE,直径3 mm),参比电极为Ag/AgCl电极,辅助电极为铂丝电极。pβ-CD/GC电极的形貌由Hitachi S-4800扫描电子显微分析仪(SEM)进行分析。

β-环糊精(β-CD)购自上海展云化工有限公司;高氯酸(HClO4)、尿酸(UA)购自国药集团化学试剂有限公司;抗坏血酸(AA)购自上海晶纯试剂有限公司;多巴胺盐酸盐(DA)购自南京奥多福尼生物科技有限公司;无水氯化钙(CaCl2)购自天津市北方天医化学试剂厂;水杨酸购自天津市光复精细化工研究所;L-谷氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司;葡萄糖购自上海山浦化工有限公司;柠檬酸购自宜兴市第二化学试剂厂;蔗糖购自北京化学试剂二厂;尿素购自宜兴市第二化学试剂厂。其它试剂均为分析纯,实验用水均为二次水。

2.2. pβ-CD/GC电极的制备

玻碳电极先用二次水超声约10 s,然后将电极在麂皮上用0.05 μm Al2O3粉末打磨抛光至呈镜面,再用二次水超声约10 s,洗净后保存在二次水中备用。

通过电聚合的方法,制备pβ-CD/GCE。具体操作如下 [14] :将干净的GC电极置于0.04 M β-环糊精溶液(溶于1 M HClO4)中,在−0.8 V~1.3 V (vs. Ag/AgCl)的电位范围内进行40圈循环伏安(CV)扫描,扫速为100 mV/s。扫描完毕,取出电极,用二次水小心淋洗电极,然后置于二次水中保存备用。

2.3. 检测方法

将GC或pβ-CD/GC电极分别置于0.1 M磷酸缓冲溶液(PBS, pH 7.4)中,利用方波伏安法(SWV),测得空白信号。再将GC或pβ-CD/GC电极分别置于含有一定浓度UA (或AA与UA混合)的PBS溶液中,测得SWV曲线,扣除空白信号,即得到响应信号。

SWV参数设置:扫描范围−0.3 V~0.6 V (vs. Ag/AgCl),振幅25 mV,频率15 Hz,电位增量4 mV。

2.4. 修饰电极的选择性

在最佳实验条件下,固定UA的浓度为50 μM,然后向UA溶液中分别加入一定浓度的干扰物(如10倍浓度的多巴胺,20倍浓度的Ca2+、水杨酸、L-谷氨酸、葡萄糖、柠檬酸,30倍浓度的蔗糖,50倍浓度的尿素),对比加入干扰物前后UA的SWV信号。

2.5. 实际尿样分析

将适量的人体尿液静置一夜,取上清液,并用PBS将其稀释3000倍。在尿液样品中加入不同量的UA,利用pβ-CD/GC电极进行回收实验。

3. 实验结果及讨论

3.1. pβ-CD/GC电极的表征

图1显示了在裸GC电极表面电聚合β-CD的CV曲线。由图可知,随着扫描圈数的增加,CV曲线上的氧化、还原峰均不断增强,说明β-CD被成功电聚合到了电极表面 [15] 。图2是pβ-CD/GC电极的SEM图,可以明显地观察到电极表面有大量纳米颗粒,直观地证明了pβ-CD/GC电极已成功制备。

3.2. UA和AA在修饰电极上的电化学行为

图3显示了GC电极和pβ-CD/GC电极在混合溶液(10 μM UA + 100 μM AA)中的SWV曲线。由图可知,GC电极上,AA的氧化峰电位约为0.13 V,峰电流约为0.89 μA;UA的氧化峰电位约为0.32 V,峰电流约为0.74 μA;二者的峰电位差约0.19 V。与裸GC电极相比,在pβ-CD/GC电极上,AA的氧化峰电位明显负移,峰电流约增加2倍;而UA的氧化峰电流约增加1倍;二者的峰电位差扩大至0.27 V。这是因为环糊精具有主客体识别作用,pβ-CD/GC电极能将溶液中的UA和AA富集在电极表面,从而使UA和AA的氧化峰电流明显增加 [16] 。同时,pβ-CD/GC电极还能有效地分离UA和AA的氧化峰电位。基于此,该修饰电极有望实现在高浓度AA条件下,对UA的灵敏测定。

Figure 1. Cyclic voltammograms of the electro-polymerization of β-CD on GCE

图1. 在玻碳电极上电聚合β-环糊精的CV曲线

Figure 2. SEM image of pβ-CD/GC

图2. pβ-CD/GC电极的SEM图

Figure 3. SWV responses at GCE and pβ-CD/GCE in the mixture of 10 μM UA and 100 μM AA

图3. GC和pβ-CD/GC电极在混合溶液(10 μM UA + 100 μM AA)中的SWV曲线

3.3. 高浓度AA对UA测定的影响

之前的实验结果表明,GC和pβ-CD/GC电极在混合溶液(10 μM UA + 100 μM AA)中均能检测到分离的UA和AA的氧化信号。但是,在生物体内,AA的浓度一般远高于UA,为了研究高浓度AA对UA测定的影响,我们考察了在不同浓度AA条件下,GC和pβ-CD/GC电极对UA的测定。

图4显示了GC电极在不同混合溶液中的SWV曲线。其中,UA的浓度固定为10 μΜ;而AA的浓度分别为10 μM、50 μM、100 μM、150 μM、200 μM、250 μM、300 μM。由图可知,在GC电极上,UA和AA的氧化峰电位相隔较小(约0.19 V)。当AA的浓度较小时(10 μΜ~100 μΜ),UA的氧化峰信号相差不大。但当AA的浓度逐渐增加到150 μM以上时,UA的氧化峰电流明显增加,且峰形变化。这是因为AA的浓度过高,AA的SWV氧化信号比较强,使得AA和UA的信号重叠,UA的峰形受到影响,最终导致UA的氧化峰逐渐消失(曲线g)。这些结果表明,虽然GC电极上可以测得分离的UA与AA的氧化信号,但当AA的浓度过高时,AA的氧化峰会对UA的信号造成较大影响 [17] 。因此,裸GC电极无法实现在高浓度AA条件下,对UA的选择性测定。

Figure 4. SWV responses at GCE in the mixtures of 10 μM UA and AA with different concentrations (a → g: 10 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM)

图4. GC电极在10 μM UA和不同浓度AA混合溶液中的SWV图。AA的浓度(a → g: 10 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM)

图5显示了pβ-CD/GC电极在不同混合溶液中的SWV曲线。其中,UA的浓度固定为10 μΜ;AA的浓度分别为100 μM (曲线a)和500 μM (曲线b)。由图可知,在pβ-CD/GC电极上,UA和AA的氧化峰电位相隔较大(约0.27 V)。当混合溶液中AA的浓度达到500 μM时,虽然AA的氧化峰信号很强,但对UA信号的影响较小。这些结果表明,pβ-CD/GC电极可以实现在高浓度AA条件下,对UA的选择性测定。

Figure 5. SWV responses at pβ-CD/GCE in the mixtures of 10 μM UA and AA with different concentrations (a: 100 μM, b: 500 μM)

图5. pβ-CD/GC电极在10 μM UA和不同浓度AA混合溶液中的SWV图。AA的浓度(a: 100 μM, b: 500 μM)

3.4. β-CD聚合圈数对检测的影响

图6(A)显示了不同聚合圈数的pβ-CD/GC电极在100 μM UA + 500 μM AA混合溶液中的SWV曲线。图6(B)直观地显示了UA的氧化峰电流随β-CD聚合圈数的变化。由图可知,随着聚合圈数的增加,UA的氧化峰电流先逐渐增大,在聚合圈数为40圈时,达到最大。这是因为电极表面修饰了更多的环糊精,能富集更多的UA。但当β-CD的聚合圈数达到50圈时,UA峰电流开始减小。这可能是因为过多的β-CD覆盖在电极表面,导致彼此的空腔被遮挡,对UA的富集效率降低。因此,实验中选择40圈为最佳的β-CD聚合圈数。

Figure 6. A: SWV responses in the mixture of 100 μM UA and 500μM AA at pβ-CD/GCE with different electro-polymerization cycle numbers (β-CD: a → e: 10, 20, 30, 50, 40). B: The effect of the electro-polymerization cycle number of β-CD on the oxidation peak current of UA

图6. A:不同聚合圈数的pβ-CD/GC电极在100 μM UA + 500 μM AA混合溶液中的SWV曲线(β-CD的聚合圈数:a → e:10,20,30,50,40)。B:UA氧化峰电流随β-CD聚合圈数的变化曲线

3.5. pβ-CD/GC电极对UA的检测

在最优的实验条件下,固定AA的浓度为500 μM,采用SWV法对不同浓度的UA进行检测。由图7(A)可知,随着UA浓度的增大,其峰电流逐渐增加。响应电流值与UA的浓度在10~500 μM范围内呈现良好的线性关系(图7(B)),其线性方程为:I (μA) = 0.07292 c (μM) + 0.6384 (R2 = 0.9990);对UA的检测下限为0.54 μM (S/N = 3)。AA与UA的氧化峰相隔较远,对UA的测定无影响。以上结果表明,该传感器可以实现在高浓度AA条件下,对UA的选择性检测。

Figure 7. A: SWV responses at pβ-CD/GCE for different concentrations of UA in the presence of 500 μM AA (a → h: 0 μM, 10 μM, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM). B: Calibration curve of the oxidation peak current of UA to its concentration

图7. A:pβ-CD/GC电极在500 μM AA和不同浓度UA的混合溶液中的SWV曲线(a → h: 0 μM, 10 μM, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM);B:UA的氧化峰电流与浓度之间的校正曲线

3.6. 修饰电极的重复性

在最优的实验条件下,制备5根pβ-CD/GC电极,分别测定100 μM UA + 500 μM AA的混合溶液,测得UA的氧化峰电流值分别为7.94 μA、8.15 μA、8.28 μA、7.55 μA、7.71 μA,五次检测结果的相对标准偏差(RSD)为3.8%,表明该修饰电极具有良好的重复性。

3.7. 修饰电极的选择性

之前的实验表明,该传感器能够有效地排除高浓度AA的干扰。在最优的实验条件下,固定UA的浓度为50 μM,加入其他可能共存的干扰物,进一步考察传感器的选择性。实验结果表明,10倍浓度的多巴胺,20倍浓度的Ca2+、水杨酸、L-谷氨酸、葡萄糖、柠檬酸,30倍浓度的蔗糖和50倍浓度的尿素对UA的检测均无明显干扰。以上结果表明该修饰电极具有良好的选择性。

3.8. 实际尿样分析

为了评估pβ-CD/GC电极对实际样品检测的性能,以人体尿液样品为例,考察了该修饰电极对UA的回收情况。将适量的人体尿液静置一夜,取上清液,并用PBS将其稀释3000倍。在最优的实验条件下,在尿样中分别加入10 μM UA、200 μM UA、400 μM UA,并进行SWV检测。实验结果如表1所示,回收率在94.32%~100.2%之间。该传感器表现出了令人满意的回收结果,有望进一步用于UA的实际检测中。

Table 1. Recovery assays of UA in real urine samples

表1. 实际尿液样品中UA的回收实验

4. 结论

本文利用电化学聚合法,成功制备了聚β-环糊精修饰玻碳电极(pβ-CD/GCE),作为传感平台。基于β-CD对UA的主客体识别作用,pβ-CD/GC电极可以有效地将UA分子富集于电极表面。相比于裸玻碳电极,该修饰电极检测到的UA的SWV氧化峰电流明显增加。此外,该电极还能有效地分离UA和干扰物AA的SWV氧化峰电位,从而实现在高浓度AA条件下,对UA的选择性测定。在优化的实验条件下,该传感器对UA的检测表现出了令人满意的结果,如宽的线性范围(10 μM~500 μM)、低的检测下限(0.54 μM, S/N = 3)、良好的重复性和选择性,其可用于实际尿样的检测中。

NOTES

*通讯作者。

文章引用:
何亚媚, 柯晓飞, 吴靓, 冯九菊. 聚β-环糊精修饰的玻碳电极对尿酸的测定研究[J]. 分析化学进展, 2019, 9(2): 71-78. https://doi.org/10.12677/AAC.2019.92010

参考文献

[1] Ndrepepa, G. (2018) Uric Acid and Cardiovascular Disease. Clinica Chimica Acta, 484, 150-163.
https://doi.org/10.1016/j.cca.2018.05.046
[2] Immanuel, S., Aparna, T.K. and Sivasubramanian, R. (2019) A Facile Preparation of Au-SiO2 Nanocomposite for Simultaneous Electrochemical Detection of Dopamine and Uric Acid. Surfaces and Interfaces, 14, 82-91.
https://doi.org/10.1016/j.surfin.2018.11.010
[3] Su, T.T., He, L., Mo, R.J., Zhou, C.X., Wang, Z., Wang, Y., Hong, P.Z., Sun, S.L. and Li, C.Y. (2018) A Non-Enzymatic Uric Acid Sensor Utilizing Ion Channels in the Barrier Layer of a Porous Anodic Alumina Membrane. Electrochemistry Communications, 96, 113-118.
https://doi.org/10.1016/j.elecom.2018.10.017
[4] Motshakeri, M., Travas-Sejdic, J., Phillips, A.R.J. and Kilmartin, P.A. (2018) Rapid Electroanalysis of Uric Acid and Ascorbic Acid Using a Poly(3,4-Ethylenedioxythiophene)-Modified Sensor with Application to Milk. Electrochimica Acta, 265, 184-193.
https://doi.org/10.1016/j.electacta.2018.01.147
[5] Wang, J., Yang, B.B., Zhong, J.T., Yan, B., Zhang, K., Zhai, C.Y., Shiraishi, Y., Du, Y.K. and Yang, P. (2017) Dopamine and Uric Acid Electrochemical Sensor Based on a Glassy Carbon Electrode Modified with Cubic Pd and Reduced Graphene Oxide Nanocomposite. Journal of Colloid and Interface Science, 497, 172-180.
https://doi.org/10.1016/j.jcis.2017.03.011
[6] Lavanya, N., Fazio, E., Neri, F., Bonavita, A., Leonardi, S.G., Neri, G. and Sekar, C. (2015) Simultaneous Electrochemical Determination of Epinephrine and Uric Acid in the Presence of Ascorbic Acid Using SnO2/Graphenenanocomposite Modified Glassy Carbon Electrode. Sensors and Actuators B, 221, 1412-1422.
https://doi.org/10.1016/j.snb.2015.08.020
[7] Zhang, L.Q., Feng, J., Chou, K.-C., Su, L. and Hou, X.M. (2017) Simultaneously Electrochemical Detection of Uric Acid and Ascorbic Acid Using Glassy Carbon Electrode Modified with Chrysanthemum-Like Titanium Nitride. Journal of Electroanalytical Chemistry, 803, 11-18.
https://doi.org/10.1016/j.jelechem.2017.09.006
[8] Zhao, D.Y., Yu, G.L., Tian, K.L. and Xu. C.X. (2016) A Highly Sensitive and Stable Electrochemical Sensor for Simultaneous Detection towards Ascorbic Acid, Dopamine, and Uric Acid Based on the Hierarchical Nanoporous PtTi Alloy. Biosensors and Bioelectronics, 82, 119-126.
https://doi.org/10.1016/j.bios.2016.03.074
[9] Reddya, Y.V.M., Sravanib, B., Agarwalc, S., Gupta, V.K. and Madhavi, G. (2018) Electrochemical Sensor for Detection of Uric Acid in the Presence of Ascorbic Acid and Dopamine Using the Poly(DPA)/SiO2@Fe3O4 Modified Carbon Paste Electrode. Journal of Electroanalytical Chemistry, 820, 168-175.
https://doi.org/10.1016/j.jelechem.2018.04.059
[10] 易银辉, 孙恒, 钱俊娟, 朱刚兵. 环糊精功能化碳纳米材料的制备及电化学分析研究进展[J]. 材料工程, 2017, 45(12): 126-134.
[11] Zhang, D.J., Zhang, J.P., Lv, P., Zhao, Y.L., Liao, X.L., Gao, C.Z. and Yang, B. (2019) Biotin-Functionalized Targeting Anti-Tumor Complex Based on β-Cyclodextrin and Methotrexate. Journal of Drug Delivery Science and Technology, 49, 152-161.
https://doi.org/10.1016/j.jddst.2018.11.015
[12] 于飞, 崔天然, 陈德贤, 姚温浩, 孙怡然, 马杰, 和怡雯. 环糊精基复合吸附剂的制备及对水中有机污染物去除的研究进展[J]. 材料导报, 2018, 32(10): 3645-3653.
[13] Gidwani, B. and Vyas, A. (2014) Synthesis, Characterization and Application of Epichlorohydrin-β-cyclodextrin Polymer. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 114, 130-137.
https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2013.09.035
[14] Zhu, G.B., Wu, L., Zhang, X., Liu, W., Zhang, X.H. and Chen, J.H. (2013) A New Dual-Signalling Electrochemical Sensing Strategy Based on Competitive Host-Guest Interaction of a β-Cyclodextrin/Poly(Nacetylaniline)/Graphene-Modified Electrode: Sensitive Electrochemical Determination of Organic Pollutants. Chemistry—A European Journal, 19, 6368-6373.
https://doi.org/10.1002/chem.201204635
[15] Zhang, X., Wu, L., Zhou, J.W., Zhang, X.H. and Chen, J.H. (2015) A New Ra-tiometric Electrochemical Sensor for Sensitive Detection of Bisphenol a Based on Poly-β-Cyclodextrin/Electroreducedgraphene Modified Glassy Carbon Electrode. Journal of Electroanalytical Chemistry, 742, 97-103.
https://doi.org/10.1016/j.jelechem.2015.02.006
[16] Gong, W., Dou, Z.-Y., Cui, L.-L., Liu, D.-J. and He, X.-Q. (2012) Elec-trocatalytic Oxidation and Simultaneous Determination of Uric Acid, Xanthine, Hypoxanthine and Dopamine Based on β-Cyclodextrin Modified Glassy Carbon Electrode. Chemical Research in Chinese Universities, 28, 1047-1053.
[17] 李宁波, 何凤云, 李丽, 胡耀娟, 白程超, 段雨晴. 高浓度抗坏血酸存在下氮掺杂石墨烯/壳聚糖修饰电极对尿酸的选择性测定[J]. 分析化学, 2015, 43(12): 1859-1863.