摘要:
寻找价格适宜的限制性内切酶，以期用于PCR-RFLP法对MTHFR基因A1298C位点的分型。根据dbSNP数据库中MTHFR基因A1298C位点的序列，通过各种在线酶切位点分析工具，查找可鉴定该位点的酶，再通过价格对比和分析多态位点上、下游是否存在干扰序列，从而确定候选酶。结合PCR创造酶切位点技术，一种价格便宜的常用酶HinfI具有鉴别该位点的潜力，不仅为该位点的独立检测并且为其与MTHFR基因C677T位点的联合检测奠定了基础。
Abstract:
The aim is to search restrictive
endonuclease with suitable price for the genotyping of A1298C locus of MTHFR gene by PCR-RFLP. According to the sequence of A1298C locus of MTHFR gene in dbSNP database, various on-line restriction site analysis tools were
used to select the enzymes that could identify the site, and then through price
comparison and analysis of whether there were interference sequences in the
upstream and downstream of the polymorphic locus, the candidate enzymes were
determined. A cheap enzyme, HinfI, has the potential to identify A1298C
locus by PCR primer introduced restriction analysis, which laid a foundation
for the joint detection of A1298C locus and C677T locus of MTHFR gene.
1. 引言
亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylene tetrahydrofolate reductase, MTHFR)是叶酸代谢通路的关键酶，其活性受基因多态性影响 [1] 。A1298C位点是MTHFR基因一个主要的功能性多态位点，它会引起一系列疾病的发病风险增加，包括神经系统疾病 [2] 、出生缺陷 [3] 及心血管疾病 [4] 等，故对该位点的基因分型具有重要的临床意义。PCR-RFLP是一种经典的基因分型方法，操作简单，但限制性核酸内切酶的成本往往会影响其推广应用，本研究旨在筛选一种可用于MTHFR基因A1298C位点分型的便宜限制性内切酶，以降低该位点的基因分型成本。
2. 方法
通过MTHFR基因A1298C位点在GenBank的dbSNP数据库中的相应ID号rs1801131查询其相关的基因组DNA序列，截取多态位点上游、下游各20个碱基用于后续分析，相关序列为：GGAGGAGCTGACCAGTGAAG[M]AAGTGTCTTTGAAGTCTTCG，M为多态位点碱基，M = A/C。在此基础上，运用如下在线酶切位点分析工具寻找相关的限制性核酸内切酶。
1) WatCut (http://watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new)，使用序列TGAAG[A/C]AAGTG进行分析。
2) dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)
用于分析的序列如下：
野生型等位基因序列：GGAGGAGCTGACCAGTGAAGAAAGTGTCTTT
突变型等位基因序列：GGAGGAGCTGACCAGTGAAGCAAGTGTCTTT
3) Enzyme Finder (https://enzymefinder.neb.com/#!#nebheader)，使用包含多态位点的几个碱基或者多态位点前的几个碱基进行分析。
3. 结果
WatCut分析结果显示，有20余种酶具有鉴定MTHFR基因A1298C位点的潜力，见表1，其中有一些为同裂酶，如：BisI和BlsI；CviAII、FaeI和FatI。dCAPS Finder分析结果显示，在通过PCR改变1个碱基后，有11种酶具有鉴定MTHFR基因A1298C位点的潜力，其中DrdII、HinfI、MwoI、TfiI、Tth111II五种酶与表1中的酶不重复或者没有对应的同裂酶。Enzyme Finder只能通过精确的碱基序列来查找相应的内切酶，获取的信息有限，见表3。
Table 1. The analysis result of WatCut
表1. WatCut分析结果
Table 2. The analysis result of dCAPS Finder
表2. dCAPS Finder分析结果
Table 3. The analysis result of Enzyme Finder
表3. Enzyme Finder分析结果
4. 讨论
对表1、表2和表3中的酶进行梳理，有同裂酶者合并后只保留其中一种，显示潜在的可用于检测MTHFR基因A1298C位点的限制性核酸内切酶有AarI、AcvI、BbsI、BisI、BspMI、BstBAI、BstC8I、BstNSI、BstV1I、CviAII、DrdII、FaiI、HgaI、HinfI、Hpy188III、HpyAV、HpyCH4V、LpnPI、MboII、MspJI、MunI、PfeI、SfaNI、SgeI、TfiI、TseI、Tth111II、TspDTI等。在上述这些酶里，MboII曾被用于MTHFR基因A1298C位点的分型，但是它的价格较贵，每个样品单次酶切用酶成本在8元以上，更主要的是在多态位点下游不远处的另一个多态位点T1317C有可能形成MboII识别序列，从而干扰基因分型，那就是当A1298C位点的等位基因为A时，T1317C位点的等位基因为C时，序列GAAG[1298A/C]AAGTGTCTTTGAAGTCTT[1317T/C]GT为GAAGAAAGTGT↑CT↓TTGAAGTCTTCGT，加下划线的GAAGA为正向的MboII识别序列，加下划线的TCTTC为反向的MboII识别序列，它们的切割位点几乎重叠在一起(箭头处) [5] ，因此MboII并不适合用于MTHFR基因A1298C位点的分型。在余下的酶中，除HinfI和AcvI外，其他的酶都较贵，每个样品单次酶切用酶成本均会超过5元。HinfI和AcvI是两种价格相对较为便宜的酶，使用HinfI每个样品单次酶切的用酶成本在1元左右，使用AcvI每个样品单次酶切用酶成本在3元左右，因此针对MTHFR基因A1298C位点用HinfI分型更具成本优势。值得一提的是，MTHFR基因另一个常见的功能性多态位点C677T通常采用HinfI分型 [6] ，故使用HinfI具备一次性联合检测MTHFR基因C677T和A1298C位点两个位点的潜力，将会大大节约MTHFR基因的分型成本和时间。
目前有多种在线酶切位点分析工具，经由它们分析所得的酶不完全相同，彼此之间具有相互补充的作用，比如本实验筛选到的廉价限制性核酸内切酶HinfI，如果仅通过WatCut软件是无法发现的，提示我们在寻找价格便宜的限制性核酸内切酶以降低实验成本时，一定要尝试采用多种在线酶切位点分析工具进行综合分析，方有可能获得比较满意的结果。
基金项目
广东省科技计划项目(公益研究与能力建设专项资金项目) (2015A030401098)资助。