世界肿瘤研究  >> Vol. 9 No. 4 (October 2019)

胃癌病理分期与长链非编码lncRNA表达的相关性研究
Study on the Correlation between Pathological Staging of Gastric Carcinoma and Expressions of Long-Chain Non-Coding lncRNA

DOI: 10.12677/WJCR.2019.94016, PDF, HTML, XML, 下载: 415  浏览: 1,705  科研立项经费支持

作者: 高希春, 钱 军*, 魏 铭, 徐星榕, 汪如荣, 辛向斌:河西学院附属张掖人民医院,甘肃 张掖

关键词: 胃癌长链非编码RNAlncRNA-19FER1L4LINC00152AK054979Gastric Cancer Long Non-Coding RNA lncRNA-19 FER1L4 LINC00152 AK054979

摘要: 目的:探讨长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)中的lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979在胃癌组织的表达。方法:收集24例胃癌患者癌组织,采用实时荧光定量PCR测定胃癌组织、癌旁组织及正常组织中lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979的表达水平,分析lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979表达与胃癌组织表达的相关性。结果:胃癌组织中lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979的表达水平呈高表达(P均 < 0.01);且与胃癌临床病理分期呈正相关(P < 0.05)。结论:lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979在胃癌组织中均高表达,且与胃癌病理分期呈正相关。
Abstract: Objective: To explore the expression of lncRNA-19, FER1L4, LINC00152 and AK054979 in long noncoding RNA (lncRNA) in gastric carcinoma. Methods: We collected 24 cases gastric carcinoma tissues. The expression levels of lncRNA-19, FER1L4, LINC00152 and AK054979 in gastric carcinoma tissues, para-cancer tissues and normal tissues were measured by real-time fluorescence quantitative PCR, and the correlation between the expressions of lncRNA-19, FER1L4, LINC00152 and AK054979 and gastric carcinoma tissues was analyzed. Results: lncRNA-19, FER1L4, LINC00152 and AK054979 were highly expressed in gastric cancer tissues (P < 0.01). It was positively correlated with the clinical pathological stages of gastric carcinoma (P < 0.05). Conclusion: lncRNA-19, FER1L4, LINC00152 and AK054979 were all highly expressed in gastric carcinoma tissues and positively correlated with the pathological stages of gastric cancer.

文章引用: 高希春, 钱军, 魏铭, 徐星榕, 汪如荣, 辛向斌. 胃癌病理分期与长链非编码lncRNA表达的相关性研究[J]. 世界肿瘤研究, 2019, 9(4): 110-117. https://doi.org/10.12677/WJCR.2019.94016

1. 引言

胃癌是危害人类健康的最常见癌症之一,根据Globocan数据库,胃癌是全球第五个最常见的癌症,在男性中甚至排在第4位,在女性中排在第5位,也是全球癌症相关死亡的第三大原因 [1] [2] 。自从2010年以来,癌症成为我国疾病死亡的首要原因,严重威胁人们的健康和生命,并已成为全球的癌症负担。新近研究发现长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)在包括胃癌等多种癌症中异常表达,为探索肿瘤发生机制、寻找新标志物和治疗靶点提供了新机遇。lncRNA是一种长度超过200个核苷酸(nucleotide, nt)的非编码RNA,在细胞核中,lncRNA具有正负调控转录、调整细胞核的亚显微结构、介导染色体相互作用的功能。多项研究表明lncRNA既可起引发癌基因的作用,促进恶性肿瘤的发生、发展,也可起抑癌基因的作用 [3] [4] [5] 。Liu等通过qRT-PCR监测组织和血浆中的FER1L4含量,发现FER1L4的表达水平在91.8% (56/61)的胃癌组织中明显下调,并且FER1L4的低表达与肿瘤大小、组织学分型、浸润程度、淋巴侵袭、远处转移、TNM肿瘤分期、血管和神经侵袭以及血清CA72-4的含量都相关 [6] [7] 。

本研究应用实时荧光定量PCR法检测胃癌组织中lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979的表达情况,并进一步分析lncRNA表达与患者临床病理的关系。

2. 资料与方法

2.1. 研究对象

收集2016年6月~2017年12月河西学院附属张掖人民医院普外及肿瘤科收治的24例胃癌患者的组织标本。24例均来自手术切除的胃癌组织。收集胃癌患者术前均未进行过化疗、放疗治疗和免疫治疗等其他治疗方案。24例患者均可准确完全查找到其临床资料信息,其中包括姓名、性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、浸润深度(见表1)、TNM分期等。排除其他部位恶性肿瘤病史;24例患者中,男性共16例,女性共8例,男女比例为2:1,年龄在42~73岁之间,中位年龄为56岁;根据国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会胃癌TNM分期标准(2010) [6] 进行TNM分期,I期6例,II期8例,III期2例,IV期4例;有淋巴结转移者14例,无淋巴结转移者10例;发生远处转移者14例,未发生远处转移者10例。胃癌组织经病理学检查确诊(见表2)。本研究经河西学院临床医学院伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书。

Table 1. Preoperative Borrmann type and pathological manifestations of gastric cancer

表1. 胃癌术前Borrmann分型与病理表现对照

Table 2. Results of preoperative enhanced MSCT T staging in 24 patients with gastric cancer were compared with pathology

表2. 24例胃癌患者术前增强MSCT T分期结果与病理对照

2.2. 实时荧光定量PCR法检测胃癌组织中lncRNA表达水平

应用TRIzol试剂和AMV反转录试剂盒(均为美国Invitrogen公司产品)提取胃癌组织的总RNA,并将其反转录成cDNA;以此cDNA为模板,应用2 × SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(美国Invitrogen公司产品)检测组织中lncRNA RP11-513G11.1的表达情况。

实验步骤

1) RNA提取

将样本分别用液氮研磨粉碎,加入1 ml Trizol (Invitrogen),吸取到1.5 ml EP管中,加入500 ul酚氯仿,振荡混匀,静止5分钟,置于离心机中于4℃离心十分钟,小心吸取上层上清于一新的离心管中,加入700 ul异丙醇,混匀,于4℃ 12,000 rpm离心10分钟,小心去上清,用75%乙醇洗涤一次,晾干,溶于50 ul DEPC处理水中,电泳检测。

2) 反转录(反转录使用Invitrogen的反转录试剂盒superscript III)

按照以下体系建立反应体系(RNA均取200 ng,补水到10 ul):

RNA 10 ul

Oligo-dT 1 ul (HOPEGENE)

Random 1 ul (HOPEGENE)

混匀,离心。65℃,5分钟,结束后置于冰上。

在上述反应体系中加入下列反应液:

dNTP (10 uM) 1ul (HOPEGENE)

0.1M DTT 2 ul

5X Buffer 4 ul

RT酶 1 ul (ABI)

混匀,离心。置于42℃,水浴60分钟。

取出后置于85℃,反应10分钟,灭活逆转录酶。反应结束后置于−20℃待用。

3) qPCR扩增

每个样本分别用待检测基因和内参基因引物扩增,每个反应做3个重复,按照以下体系建立扩增体系(20 ul):

cDNA 2 ul

qPCR mix 10 ul

primer F 1 ul

primer R 1 ul

ddH2O 6 ul

于ABI 7900 qPCR仪上,按照以下条件反应:

95℃ 2 min

94℃ 20 s

60℃ 20 s

72℃ 30 s 40循环

根据目的基因分别设计合成引物,引物序列见列表3

Table 3. Primer sequence list

表3. 引物序列表

所有引物为美国Invitrogen公司产品。PCR反应条件:95℃ 20 s;95 ℃ 10 s、60℃ 20 s,共40个循环。

2.3. 统计学方法

应用SPSS18.0统计软件包处理数据,对研究的结果数据进行统计分析。结果以均数±标准误差(mean ± SD)表示,采用配对t检验进行两样本均数之间的比较,P < 0.05认为差异具有统计学意义。胃癌组织中lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979的表达与胃癌患者临床病理参数之间的关系采用X2检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

3. 结果

釆用北京华普奥科生物科技有限公司基因芯片,对胃癌肿瘤组织标本中筛选出lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979四种高表达lncRNA检测基因。然后应用实时荧光定量PCR法检测24例胃癌组织lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979的表达水平显著升高(见图1~5 QPCR结果扩增曲线及相应的溶解曲线)。课题研究显示,胃癌组织中lncRNA-19、FER1L4、LINC00152及AK054979的表达水平显著shenggao升高,均有统计学意义(P值均 < 0.01)。和临床资料分析结果表明:lncRNA在胃癌组织中的表达水平与分化程度、是否淋巴结转移、TNM分期有关,其表达程度越高,分化程度也越高。

QPCR的结果:

Figure 1. Amplification curve and dissolution curve of Actin gene

图1. 基因Actin扩增曲线及其溶解曲线

Figure 2. Amplification curve and dissolution curve of lncRNA-H19 gene

图2. 基因lncRNA-H19扩增曲线及其溶解曲线

Figure 3. Amplification curve and dissolution curve of lncRNA-FER1L4 gene

图3. 基因lncRNA-FER1L4扩增曲线及其溶解曲线

Figure 4. Amplification curve and dissolution curve of lncRNA-LINC00152 gene

图4. 基因lncRNA-LINC00152扩增曲线及其溶解曲线

Figure 5. Amplification curve and dissolution curve of lncRNA-AK054979 gene

图5. 基因lncRNA-AK054979扩增曲线及其溶解曲线

4. 讨论

癌症的发展有一个过程,以胃癌为例,经历了从癌前病变(异型增生)到早期胃癌,最后发展为进展期胃癌 [8] [9] 。癌前病变不但是组织发生癌变的关键性步骤,而且更为肿瘤的早期诊断和预防提供了坚实的基础。目前已有研究发现lncRNA不但在癌组织中异常表达,而且部分在癌前病变组织中也出现异常表达 [10] [11] [12] 。与癌旁正常组织相比,lncRNA在肿瘤组织中或过表达或低表达甚至失表达,以此特异性表达来实现其调节作用,并且这种特异性表达有望成为新的肿瘤预测因子 [13] [14] [15] [16] 。Li [17] 等研究发现,血浆中lncRNALINC00152对胃癌的诊断灵敏度和特异度分别为48.1%和85.2%,并能在外周血中稳定存在。

目前对于lncRNA的认识尚处在初级阶段,但已有研究发现这类分子在细胞分化、生长、新陈代谢过程及肿瘤发生中起到至关重要的作用。在分子生物学领域中,以新兴的lncRNA为代表的肿瘤表观遗传学在短短数年间得到了长足进展。H19是最早被发现的癌症相关lncRNA,它是胰岛素样生长因子2 (insulin-like growth factor2, lgf2)的印迹基因的产物,一般只在胚胎组织中出现表达,而不在成年组织中表达,但是研究发现它在组织再生或者发生肿瘤时则被重新激活。此后的研究发现,H19具有抑制癌细胞凋亡、促进癌细胞增殖、增强细胞对缺氧的耐受能力和促进新生血管出现等作用 [16] [17] 。随着当前癌症相关基因转录研究的迅速进展,越来越多的肿瘤相关lncRNA被发现。现阶段,对于lncRNA的研究还大多集中于组织学上,而我们则与临床密切结合,将目标聚集在血浆中的lncRNA的测定。本研究拟通过基因芯片技术筛选胃部癌相关lncRNA,发现在肿瘤组织中表达异常的lncRNA;然后运用生物信息学技术预测胃部癌相关lncRNA的靶基因,为研究lncRNA的功能、信号通路及在胃部癌发生发展中的作用奠定基础。从疾病的生物分子水平来了解和认识胃部肿瘤的生物学特征,进一步明确相关lncRNA基因在胃部癌发生和发展中的作用,以期寻找胃连接部癌早期诊断、早期治疗以及检测依据,并对肿瘤的浸润转移以及预后做出较为准确的估计。最后结合患者的临床影像病理因素,分析lncRNA与MSCT、临床病理因素的相互关系,探讨lncRNA的临床意义,以提高胃部癌的非创性诊断水平。

基金项目

甘肃省高等学校科研项目资助(项目编号:2017B-37)。

NOTES

*通讯作者。

参考文献

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