1. 引言
北虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草、蛹虫草，是虫草属的模式种菌，属子囊菌亚门虫草属，食用价值较高。现代研究发现，北虫草和冬虫夏草的药用价值及保健价值较相近 [1] 。近年来，由于北虫草具有多种药用价值，受到研究者越来越多的关注 [2] 。现代医药学从药理及临床疗效方面更进一步验证了虫草的医疗保健功能，阐明了其治病强身的机理。测定结果显示，北虫草中含有虫草素、虫草多糖、虫草酸、多种人体必须的氨基酸、多种微量元素和超氧化物歧化酶(SOD)等多种营养物质和抗癌抗衰老的活性物质 [3] 。
蛹虫草多糖具有耐热、盐，调节pH的作用 [4] [5] ，除此之外还有如降血糖、抗肿瘤、抗菌活性、抗氧化活性、增强单核巨噬细胞系统的功能，强化巨噬细胞吞噬能力 [6] [7] 。俞丽霞等研究发现，虫草多糖的不同多糖组分均有免疫增强作用，可提高脾脏指数和胸腺指数，增强单核–巨噬细胞的吞噬能力 [8] 。大多数研究说明，使用虫草多糖的小鼠，其血清IgM和IgG的含量显著增高。另外，虫草多糖也可明显增强荷瘤小鼠的迟发型变态反应，显著提高外周血淋巴细胞酸性非特异性酯酶阳性细胞百分率。
免疫佐剂是通过富集免疫原(如铝胶)、缓释免疫原(如油乳剂)、激活抗原提呈细胞单核吞噬细胞系统递呈抗原(如卡介苗、细菌脂多糖)以及多种综合作用(如不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂)来实现对免疫原的免疫增强作用 [9] [10] 。目前唯一被FDA批准用于人用疫苗的佐剂有铝胶佐剂，当然也有越来越多的新型佐剂被开发并逐渐应用到生成实践中，如MF59等。我国的中药有着毒副作用小，对机体免疫提升效果好，目前研究的比较多的是人参皂甙的佐剂活性 [11] 。北虫草多糖是否也能作为疫苗佐剂来使用，有待进一步研究。本研究旨在探索北虫草多糖作为疫苗佐剂的效果，并为进一步开发其它具有免疫佐剂活性的真菌类提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 试验动物
雌性ICR小鼠，18~22 g，购自上海实验动物中心。小鼠饲养于22℃清洁环境，自由采食和饮水，自然光照，适应3 d后分组。
2.1.2. 试剂
卵清白蛋白(OVA, grade V)，美国sigma公司；羊抗小鼠IgG抗体，CHEM ICON Internati onal Inc.；TMB，SIG2MA-ALDR ICH公司；IgG2a，Santa CruzBi otechnol ogy Inc.；硅胶G 200~300目，青岛洋化工有限公司；D101中性大孔树脂，天津市海光化工有限公司产品。
2.1.3. 北虫草多糖粗提物制备
木鳖子3000 g，用石油醚脱脂3次，每次10.5 L，共去掉脂质601.5 g。残渣用70%乙醇
60 ℃
回流提取5次，每次12 L，合并提取液，减压浓缩至1.25 g/ml。
2.2. 方法
2.2.1. 实验动物及其免疫
ICR小鼠35只随机分成7组，每组5只。每只小鼠颈部皮下注射含OVA (10 μg)和组分A、B、C、D、E或者ECMS (50 μg)的生理盐水溶液，对照组小鼠注射含OVA的生理盐水溶液。2周后进行二免，二免后3周采血，制备血清。
2.2.2. I gG效价的测定
在96孔酶标板每孔加入 100 μL包被液(含5 μg OVA/mL的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液)，置
4 ℃
孵育18 h后，洗涤液(pH 7.4磷酸盐缓冲液PBS)洗涤3次，每次3 min。每孔加入300 μL含1%小牛血清的PBS封闭液(0.01 mol /L, pH 7.4)，于
37 ℃
孵育1 h后，再用洗涤液洗涤3次，每次3 min。用稀释液将待测血清在酶标板上作二倍稀释，使血清稀释度为1:50~1:3 200。于
37 ℃
孵育2 h后，用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入经1:500稀释的羊抗小鼠IgG抗体100 μL/孔，37℃孵育2 h，再用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入T MB底物溶液显色，100 μL/孔，37℃孵育15 min加1 mol/L H2 SO4 50 μL/孔终止反应。用酶标仪在450 nm波长测定OD值。
2.2.3. IgG亚类测定
在已包被抗原OVA的96孔酶标板上加入1:800倍稀释的待检血清(100 μL/孔)，37℃孵育1 h，用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入经1:600稀释的生物素标记的山羊抗小鼠IgG1或IgG
2a
100 μL/孔，37℃孵育1 h，用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素100 μL/孔，37℃孵育1 h，用洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入TMB底物溶液显色，100 μL/孔，37℃孵育15 min加1 mol/L H2 SO4 50 μL/孔终止反应。用酶标仪在450 nm波长测定OD值。
2.2.4. 淋巴细胞转化试验
将小鼠脱颈椎处死，75%酒精液浸泡5~10 min，无菌操作取小鼠脾脏，加入1 mL Hank’s研磨，研磨均匀后将脾细胞吹悬入平皿，过200目铜网后转移入10 mL离心管；25℃下1500 rpm离心10 min；PBS洗涤2次；细胞计数后，调整细胞浓度至2.5 × 106/mL，按100 µl/孔的量加入96孔细胞培养板中。用细胞培养液配制各种刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS终浓度为5 µg/mL，ConA终浓度为7.5 µg/mL，设阴性对照和空白对照)。
37 ℃
、5% CO2培养箱中培养48 h。在培养结束前4 h，每孔加入50 µl MTT (2 mg/mL)。然后将培养板取出，离心(1500 rpm, 10 min)沉淀细胞，轻轻倾去培养液上清，纸巾吸干。每孔加入150 µl二甲基亚砜，避光充分振荡，直至蓝色颗粒完全溶解，570 nm波长酶标仪检测OD值。计算淋巴细胞刺激指数(Stimulation index, SI)：
SI = (刺激孔OD − 空白孔OD)/(未刺激孔OD − 空白孔OD)。
2.2.5. 细胞因子mRNA检测
1) 脾淋巴细胞体外刺激。将述分离到的脾淋巴细胞悬液调整细胞浓度至1 × 107 cell/ml，铺板培养于24孔板，每孔2 ml。向培养板内加入刺激物(H1N1流感抗原)，至HA终浓度为2 μg/ml，将细胞培养于37℃，5% CO2的环境中，抗原刺激15 h后离心收集细胞，加入RNA提取试剂溶解后保存细胞裂解液于−80℃。
2) Total RNA提取。RNAisoTMPlus (TaKaRa Co., Ltd.)提取细胞总RNA，方法参照厂家说明书。RNA提取效果电泳鉴定：使用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。
3) 反转录。采用iScript cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录成cDNA，方法见说明书；获得的cDNA样品置于−20℃保存备用。
4) 引物及探针设计。采用实时荧光定量双重PCR方法检测目的基因的相对表达量，以小鼠β-acting为内参基因，使用ABI 7300荧光定量PCR仪；目的基因探针
5’
端以FAM标记，β-actin探针
5’
端HEX标记，目的基因和内参基因
3’
端均采用BHQ-1标记。引物和探针序列设计采用软件Primer Express 3.0；基因产物均经过DNA测序鉴定。
5) Real-time PCR反应体系及条件。采用总体积为25 μl的反应体系，依次加入1 × Taq-Man通用反应预混液、目的基因引物和探针、β-actin引物和探针(见表1)、cDNA模板(2 μl)。PCR反应程序采用标准TaqMan条件：95℃ (15 sec)，60℃ (30 sec)，45个PCR循环。
Table 1. Sequences of primer and probe for quantitative RT-PCR of cytokine and transcription factor
表1. 细胞因子及转录因子RT-PCR用引物和探针序列
6) 相对定量计算方法。设定荧光阈值(处于基因扩增信号的对数增长期(logarithmic phase)内的某个阀值(thresholds)被指定为Ct值)，根据不同管内扩增曲线中对应荧光阈值确定样品Ct值。采用2-∆∆CT法(29)进行相对定量分析。
2.2.6. 统计学分析
采用SPSS 12.0单因素方差分析方法比较组间均数差异，显著性水平设P < 0.05。
3. 结果与分析
3.1. 北虫草多糖佐剂对血清特异性IgG，IgG1及IgG2a的影响
由图1可知，北虫草多糖佐剂组均高于抗原单独免疫组，而中剂量虫草多糖佐剂组与阳性对照组小鼠血清IgG抗体水平要显著高于抗原单独免疫组。由图2可知，北虫草多糖低剂量组小鼠血清中IgG1和IgG
2a
水均显著抗原单独免疫组小鼠，其它剂量多糖组在两种抗体亚类水平上均略高于抗原单独免疫组小鼠，铝胶仅能诱导Th2型免疫反应，而抗体亚类检测结果也反应出铝佐剂组小鼠仅有IgG1水平显著升高。
Figure 1. Effect of Cordyceps militaris Polysaccharide adjuvant on IgG antibody
图1. 北虫草多糖佐剂对IgG抗体的影响
Figure 2. Effect of Cordyceps militaris Polysaccharide adjuvant on IgG antibody
图2. 北虫草多糖佐剂对IgG抗体的影响
3.2. 淋巴细胞转化试验结果
由图3可知，北虫草多糖佐剂组小鼠T/B淋巴细胞均被激活，尤其是中剂量组，对淋巴细胞的刺激指数显著高于抗原单独免疫组。本结果提示，北虫草多糖能有效激活机体免疫细胞，对机体细胞免疫反应有促进作用。
Figure 3. Effect of Cordyceps militaris Polysaccharide adjuvant on lymphocyte transformation
图3. 北虫草多糖佐剂对淋巴细胞转化的影响
Figure 4. Effects of Cordyceps militaris Polysaccharide adjuvant on cytokines
图4. 北虫草多糖佐剂对细胞因子的影响
Figure 5. Effects of Cordyceps militaris Polysaccharide adjuvant on cytokine IL-12
图5. 北虫草多糖佐剂对细胞因子IL-12的影响
3.3. 北虫草多糖佐剂对各类细胞因子的影响
由图4、图5、图6及图7可知，北虫草多糖粗提物佐剂组能有效诱导IFN-γ、IL-12、IL-4，尤其是中剂量多糖佐剂组，所诱导的各种细胞因子mRNA表达水平要显著高于抗原单独免疫组。铝佐剂仅能诱导Th2类细胞因子IL-4和IL-10 mRNA的表达。
Figure 6. Effects of Cordyceps militaris Polysaccharide adjuvant on cytokine IL-10
图6. 北虫草多糖佐剂对细胞因子IL-10的影响
Figure 7. Effects of Cordyceps militaris Polysaccharide adjuvant on cytokine IL-4
图7. 北虫草多糖佐剂对细胞因子IL-4的影响
4. 小结与讨论
北虫草多糖可与红细胞膜上的受体结合，促进巨噬细胞的吞噬功能。虫草多糖脂质体对体外培养的外周血淋巴细胞，可单独或协同PHA (植物血凝素)诱导IL-2受体的表达，促进可溶性IL-2的生成，但对PHA诱生的IL-2有选择性抑制作用，提示其有双向调节作用。沈敏等研究表明，虫草多糖能使胸腺中不成熟CD4、CD8双阳性细胞发育为成熟的单阳性细胞，从而增加胸腺中CD4+和CD8+的数量 [12] 。
由本实验结果可以推测北虫草多糖能有效提高机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应，北虫草多糖对Th1和Th2类细胞因子均有明显的提升左右，表明机体的免疫应答机制可能被激活，另外北虫草多糖可能对体液免疫和细胞免疫反应的平衡上具有一定的调节作用，能有效提高机体对疫苗的免疫应答反应。本实验结果与陈孜等关于人工虫草多糖对免疫抑制小鼠免疫调节作用的研究 [13] ，证实人工虫草多糖能够拮抗环磷酰胺的免疫抑制作用，进而有效提高机体免疫功能结果相一致，将为进一步开发利用北虫草多糖提供科学依据。
基金项目
国家蚕桑产业技术体系湖州综合试验站(CARS-18-SYZ06)。