基于网络药理学探讨葛根解酒的作用机制

Exploring the Mechanism of Gegen Hangover Based on Network Pharmacology

摘要: 目的：运用网络药理学的方法，预测葛根的活性成分和作用靶点，揭示葛根解酒的分子作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库(TCMSP)检索葛根中所含的全部化学成分，以ADME参数(OB ≥ 30%和 DL ≥ 0.15)，筛选具有活性的化学成分，并查找活性化学成分对应的靶点蛋白，建立靶点数据集；使用Cytoscape3.6.1软件构建“活性成分–靶点–疾病”复杂网络关系图；通过生物学信息注释数据库(DAVID)进行GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析，探明葛根解酒的作用机制。结果：共检索出18个化合物，其中4个化学成分为活性化合物；共检索出92个作用靶点。通过网络拓扑特征评价，筛选出8个潜在作用靶点与葛根解酒的作用机制最为密切；利用DAVID数据库对潜在作用靶点进行基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，筛选出35个生物过程和28条信号通路参与葛根解酒的作用。其中与葛根解酒较为密切的信号通路包括神经活性配体–受体相互作用、钙信号途径、胆碱能突触、心肌细胞中的肾上腺素信号、PI3K-AKT信号通路、VEGF信号通路、p53信号通路、NAFLD等信号通路，同时其主要涉及的生物过程包括雌二醇反应、突触传递、胆碱能、腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、磷脂酶C激活G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、γ-氨基丁酸信号通路、RNA聚合酶II启动子转录的阳性调控作用、细胞色素c激活参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性等，从而发挥多成分、多靶点、多途径解酒的生物学效应。结论：网络药理学为葛根解酒的作用机制提供了研究方向及科学依据。

Abstract: Objective: To predict the active constituents and targets of Radix Puerariae by using network pharmacology, and to reveal the molecular mechanism of Gegen hangover. Methods: All the chemical components contained in Radix Puerariae were searched by the Chinese Medicine System Pharmacology Database (TCMSP). The active chemical constituents were screened by ADME parameters (OB ≥ 30% and DL ≥ 0.15), and the target proteins corresponding to the active chemical com-ponents were searched to establish the target data set. Cytoscape3.6.1 software was used to construct the complex network diagram of “active ingredient - target – disease”. The GO biological function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were carried out through the annotation database of biological information (DAVID) to explore the mechanism of Gegen antidotes. Results: A total of 18 compounds were retrieved, 4 of which were active compounds; a total of 92 targets were retrieved. Through the evaluation of network topological characteristics, the screening of 8 potential targets was the most closely related to Gegen hangover. Using the DAVID database to analyze the potential target targets for gene GO function enrichment and KEGG pathway enrichment, 35 were screened. Biological processes and 28 signaling pathways are involved in the role of Pueraria hangover. The signaling pathways that are more closely related to Pueraria hangover include neuroactive ligand-receptor interaction, calcium signaling pathway, cholinergic synapse, adrenergic signal in cardiomyocytes, PI3K-AKT signaling pathway, VEGF signaling pathway, p53 signal pathways, signaling pathways such as NAFLD, and its main biological processes include estradiol response, synaptic transmission, cholinergic, adenylate cyclase inhibition of G protein- coupled acetylcholine receptor signaling pathway, and phospholipase C activation G protein- coupled acetylcholine receptor signaling pathway, γ-aminobutyric acid signaling pathway, positive regulation of RNA polymerase II promoter transcription, cytochrome c activation, and cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptosis, thereby exerting the biological effects of multi-component, multi-target, multi-channel hangover. Conclusion: Network pharmacology provides research direction and scientific basis for the mechanism of Gegen hangover.

1. 引言

在全球范围内，酗酒是导致全球中青年死亡的主要风险因素之一 [1]。在2016年，酒精中毒是死亡和DALYs (伤残调整生命年)的第七大风险因素，占死亡总数比例2.2% [2] [3]。中国是全球饮酒致死人数最多的国家，饮酒不仅已成为全球性公共卫生健康问题，同时也是我国日益突出的社会问题 [4]。急性酒精中毒是指由于一次性饮入过量的酒精或酒精类饮料引起的中枢神经系统由兴奋转为抑制的状态，也称为醉酒 [5] [6] [7]。研究表明，虽然适度饮酒可降低死亡风险 [8]，但是饮酒过度引起的健康问题与社会问题日益严重，且饮酒与多种疾病的发生机制皆有关联，例如心血管系统疾病、糖尿病、酒精性肝病(ALD)等 [9] [10] [11]。葛根已被证明是非常有效的并且被广泛使用，目前在中国用于单独或联合解酒 [12]。因此，进一步研究葛根对于解酒的分子机制起着至关重要的作用。

葛根(Pueraria lobata)为豆科植物野葛的干燥根，具有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻、通经活络、解酒毒之功效。临床上常用于治疗表证发热、项背强痛、麻疹不透、热病口渴、阴虚消渴等症 [13]。葛根为药食两用植物 [14]，历代医药著作常用于解酒的药用频率居诸药之首。据《神农本草经》、《汤液本草》、《本草拾遗》、《千金方》等本草著作记载；葛根能“治酒醉不醒”且“解酒毒尤良”。现代研究表明，葛根主要含有异黄酮及其苷类化合物(葛根素、大豆苷、大豆苷元等)、香豆素类及葛酚苷类化合物(拟雌内酯、葛香豆雌酚等)以及三萜类(葛根皂苷SA1、SB1、A1、C1等)等成分，而其“解酒毒”的主要成分为总黄酮类，体内动物实验研究也表明葛根解酒作用显著 [15] - [21]。研究表明，葛根解酒作用可通过在胃肠粘膜上形成保护膜而阻断人体对酒精的吸收，从而影响酒精吸收 [22] [23] [24] [25]，也可通过其异黄酮清除氧自由基和抗脂质过氧化损坏，从而发挥抗氧化作用，起到保肝健脑的作用 [26]。目前，葛根产品的开发利用越来越丰富，如葛根保健饮料、葛粉、葛根面包等 [27]。因此，探明葛根解酒的作用机制对其解酒的现代科学内涵具有十分重要的指导意义。虽然目前有关葛根解酒作用的药效研究比较集中，但从细胞及分子水平研究葛根解酒的作用机制相对比较缺乏。近年来，网络药理学整体性、系统性的特点与中药“多成分、多途径、多靶点”协同作用的特点不谋而合，为中医药复杂系统的研究提供了新的视角和思路 [28] - [33]。因此，本文采用网络药理学的方法，对葛根活性成分解酒的作用靶点及信号通路进行分析，以期探明葛根解酒的现代科学内涵，也为葛根的深入研究及开发利用提供参考依据。拟从分析葛根解酒的作用机制出发，建立完善的酒精中毒诊疗体系，通过预测其网络药理学作用靶点，从而揭示其解救急性酒精中毒的分子机制。

2. 方法

2.1. 化学成分的建立

通过中药系统药理学分析平台(TCMSP) (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，检索葛根所含的全部化学成分。TCMSP不仅是一个数据存储库，也是用户全面研究中药(TCM)的分析平台。将葛根放入TCMSP中，共得到16个分子，其中包括活性成分的鉴定，药物靶标的筛选和化合物–靶标–疾病网络的产生，以及详细的药物动力学信息涉及药物样(DL) Drug-likeness，口服生物利用度(OB) Oral bioavailability，血脑屏障(BBB) Blood-brain barrier，肠上皮通透性(Caco-2) Caco-2 permeability等。

2.2. 活性成分的筛选

通过TCMSP数据库，以ADME参数(OB ≥ 30%和DL ≥ 0.15)为标准，筛选葛根的活性化学成分。

2.3. 靶点的筛选与建立

通过TCMSP数据库，检索葛根活性成分对应的作用靶点，建立成分靶点数据集。再依据相似性比较，通过中草药活性成分数据库(HIT, http://lifecenter.sgst.cn/hit/)和治疗靶点数据库(TTD, http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)进行活性成分潜在靶点的筛选，建立葛根活性成分潜在靶点数据集，并通过人类基因和基因表型综合数据库(OMIM, http://www.omim.org/)筛选解酒的基因和蛋白靶点，建立解酒靶点数据集。人类的靶点连接蛋白通过交互蛋白数据库(http://dip.doe-mbi.ucla.edu)获得。最后将筛选得到的所有靶点均经UniProt数据库查询转化成UniProt ID格式，所有靶点涵盖了动物及人类靶点，所以需要使用UniProt数据库转化人类靶点，将动物靶点转化为与人类相关靶点。

2.4. 网络构建与分析

通过PPI (http://www.genome.jp/kegg/)分析，将葛根的活性成分、成分对应的靶点、解酒对应的靶点和交互蛋白对应的靶点连接成“成分–靶点–疾病”网络。利用Cytoscape 3.6.1软件将以上网络进行可视化分析，得到每个节点的Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality三个拓扑参数；通过CentiScaPe 1.2进行评估，得到葛根解酒的潜在靶点。

2.5. 生物过程分析

将潜在靶点使用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)数据库进行KEGG通路分析和GO (Gene Ontology)生物学过程分析。

3. 结果

3.1. 活性成分的筛选

通过TCMSP数据库，检索得到18个葛根的化学成分，以ADME参数(OB ≥ 30%和DL ≥ 0.15)为标准，共筛选得到4个活性化合物，结果见表1。

Table 1. Kudzu root active compounds and targets

表1. 葛根活性化合物及靶标数

3.2. 药物靶点和疾病靶点数据的筛选

通过TCMSP数据库，共筛选得到92个葛根活性化学成分对应的作用靶点，结果见表1。通过OMIM数据库，查找得到49个解酒相关的靶点。通过网络药理学构建出葛根解酒作用的交互网络，采用不同颜色和形状图形使其可视化后，可直观的看出活性化学成分与疾病靶点之间的网络关系，结果见图1。其中，黄色方形代表药物与疾病的作用靶点，也是葛根解酒最重要的靶点蛋白；黄色圆点代表解酒直接作用靶点；红色三角形代表葛根中被预测出的活性化学成分；蓝色圆点代表葛根活性化学成分的直接作用靶点；紫色圆点代表连接葛根活性化学成分与疾病靶点的交互蛋白。

Figure 1. “Composition-target-disease” interactive network of Pueraria hangover

图1. 葛根解酒的“成分-靶点-疾病”交互网络

3.3. 葛根解酒的直接作用靶点拓扑参数分析

通过Cytoscape 3.6.1软件进行交互网络分析，得到葛根活性成分相关联的蛋白靶点。通过计算得到网络中三个拓扑参数(Degree、Betweenness centrality和Closeness centrality)分别为：1.00、0和0.167。将上述筛选出的靶点作为葛根解酒的潜在靶点蛋白，共得到8个靶点满足以上条件，结果见表2。将潜在靶点蛋白进行蛋白相互关系分析，结果见图2。蛋白相互关系分析说明葛根解酒的潜在靶点蛋白相互关联和彼此调节。

Table 2. Topological parameters related to the direct action target of Pueraria Radix

表2. 葛根活性成分解酒的直接作用靶点相关拓扑参数

Figure 2. Map of potential target proteins for Pueraria hangover effect

图2. 葛根解酒作用的潜在靶点蛋白相互关系图

3.4. GO生物学功能分析

将8个潜在靶点映射到DAVID数据库中，进行生物学功能富集。GO富集分析，得到222个生物学进程、39个细胞组成和67个分子功能，其中P值 ≤ 0.001的生物进程共有35条，结果见表3。结果表明，这些靶点与多种生物进程相关，包括对雌二醇反应、突触传递、胆碱能、腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、磷脂酶C激活G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、细胞色素c激活参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性等，且这些生物进程可能与解酒的作用密切相关。同时揭示出了中药发挥药效作用涉及体内多个生物进程的调控。

Table 3. Results of GO biological enrichment analysis of Pueraria hangover effect

表3. 葛根解酒作用的GO生物学功能富集分析结果

3.5. KEGG通路分析

将8个潜在靶点映射到DAVID数据库中，进行KEGG通路富集分析，共得到76条信号通路，其中P值 ≤ 0.001的信号通路共有28条，结果见表4。其中神经活性配体–受体相互作用、钙信号途径、胆碱能突触、心肌细胞中的肾上腺素信号、PI3K-AKT信号通路等、VEGF信号通路、p53信号通路、NAFLD等信号通路可能直接或间接参与葛根解酒的作用。此结果与解酒机制可能紧密相关。同时利用KEGG信号通路数据库中的KEGG Mapper功能将8个葛根与解酒相关联的靶点蛋白，在与GABA能突触最为密切的信号通路上标注出来，结果显示有4个靶点蛋白参与GABA能突触信号通路的相关调控，结果见图3。

Table 4. KEGG pathway enrichment analysis of Pueraria hangover effect

表4. 葛根解酒作用的KEGG通路富集分析结果

Figure 3. Labeling of potential targets of Pueraria lobata on key signal pathways

图3. 葛根活性成分潜在靶点在关键信号通路上的标注图

4. 讨论

Figure 4. Pueraria hangover mechanism

图4. 葛根解酒作用机制图

葛根是国家卫生部认定的药食两用中药，2005年被世界粮农组织推荐为第六大类粮食作物 [34]。葛根中异黄酮类活性成分具有防醉酒，醒酒和对抗酒精肝损伤等作用 [35] - [42]，但其具体作用机制尚未完全阐明。随着基因、蛋白和代谢组学的发展，许多学者尝试用现代医学解释中药的作用机制。但由于葛根所含的化学成分比较复杂，难以系统全面的揭示其药效物质基础和作用机制，给葛根的深入研究带来了难题。近些年，网络药理学的兴起，为中药药效物质基础和作用机制的研究提供了新的思路和方法，也进一步推动了中医药的快速发展。因此，通过网络药理学揭示葛根解酒的作用机制非常有意义。如图4。

目前，有关葛根解酒作用机制的研究还不够全面，宋浩亮等 [43] 分别给小鼠灌胃葛根素溶液和饮用酒后，观察各组小鼠醉酒潜伏期明显延长，睡眠时间显著缩短；同时各组小鼠体内SOD、MDA、GSH-PX、GSH发生异常变化，结果给药组能够接近于正常水平。Zhang等 [44] 研究发现葛根素能明显改善肝纤维化症状，显著降低ALT和AST的表达，而碱性磷酸酶(ALP)与谷氨酰转移酶(GGT)无明显变化，肝脏星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)的吞噬能力增强，bcl-2 mRNA表达下降；结果说明葛根素可通过恢复肝脏功能，激活HSC的吞噬能力，从而达到有效防治肝脏纤维化，发挥解酒的作用。

本文采用网络药理学的研究方法，筛选出35个生物过程和28条信号通路参与葛根解酒的作用。其中与解酒相关的主要信号通路包括神经活性配体–受体相互作用、钙信号途径、胆碱能突触、心肌细胞中的肾上腺素信号、PI3K-AKT信号通路、VEGF信号通路、p53信号通路、NAFLD等信号通路，同时其主要涉及的生物过程包括雌二醇反应、突触传递、胆碱能、腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、磷脂酶C激活G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、γ–氨基丁酸信号通路、RNA聚合酶II启动子转录的阳性调控作用、细胞色素c激活参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性等，从而发挥多成分、多靶点、多途径解酒的生物学效应。网络药理学通过预测葛根解酒的作用靶点及信号通路，以期为葛根的保健作用及深入研究提供参考依据。

NOTES

^*通讯作者。