1. 引言
不论肿瘤患者有无接受治疗，贫血都是常见的，被命名为肿瘤相关性贫血(CRA)。目前最大的调查研究之一，欧洲癌症贫血调查(ECAS) [1] 中发现，15,367名接受化疗的患者中有39%在随后6个月被发现贫血(Hb < 10.0 g/dL)。CRA的发病机理很复杂，通常很难识别，在大多数情况下是多因素的，并且与非CRA患者相比，有CRA病史的患者有可能会导致更加严重程度的贫血 [2]。
CRA患者中有一部分没有明确病因，这种情况下的贫血多归为慢性病贫血(ACD) [3]。潜在机制目前尚未完全清楚，但认为涉及肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1等炎性细胞因子 [4]。这些细胞因子可能抑制内源性EPO生成，损害造血过程中铁利用并减少红细胞前体的增殖 [5]。这种慢性炎症状态还会引起机体营养和代谢的变化，如体重减轻、低白蛋白血症、活性氧(ROS)增加等 [6]。这些因素交互作用，也使机体产生对EPO的抵抗。因此，分析所有导致CRA的因素至关重要，尤其在开始可能加剧贫血的任何治疗之前。
本研究旨在明确儿童CRA血清EPO水平变化，有无EPO绝对或相对缺乏，以及EPO与TNF-α水平的相关性，明确有无以TNF-α为代表的炎症细胞因子的增高导致机体对EPO抵抗和钝化，分析CRA的发病机制。
2. 对象与方法
2.1. 对象
收集2018年05月至2019年12月青岛大学附属医院医院血液儿科收治患儿为研究对象。恶性肿瘤组：75例，原发疾病为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、淋巴瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤等，均符合相关疾病诊断标准，其中贫血组42(男26女16)例，年龄1~14 (7.2 ± 4.8)岁；未贫血组33 (男17女16)例，年龄1~13 (5.3 ± 2.7)岁；非肿瘤性贫血组：18 (男8女10)例，年龄1~15 (6.5 ± 4.2)岁，原发疾病为缺铁性贫血(IDA)、巨幼细胞性贫血等有非肿瘤性血液病；健康对照组：15 (男8女7)例，年龄1~10 (4.2 ± 3.8)岁，因健康查体于门诊就诊，无贫血且既往无慢性疾病及血液病史。以上所有患儿肾功能都正常。贫血的定义：6~59个月：<11.0 g/dL；5~11岁：<11.5 g/dL；12~16岁：<12.0 g/dL [7]。排除标准为：1) 病例资料极度不完整者；2) 伴有明显低氧血症；3) 有溶血及急、慢性失血，有贫血家族史；4) 合并其他慢性炎症性疾病如支气管哮喘、类风湿关节炎、炎症性肠病等；5) 目前有铁剂、维生素B12或叶酸治疗；6) 2周内有放化疗史，3月内有输血、ESAs及铁剂治疗史，近半年有手术史。分析EPO时采用的对照组：非肿瘤性贫血组18例(研究表明IDA患者EPO的反应增生能力正常)、健康对照组15例；分析TNF-α时对照组：健康对照组15例。本研究通过青岛大学附属医院医学伦理委员会批准。
2.2. 方法
2.2.1. 标本采集与处理
抽取晨醒后患儿外周静脉血3~4 ml放置于添加了分离胶–促凝剂的试管中混匀，4℃，3000 r/min离心5 min，取上层血清置于−80℃冰箱中冷冻保存。
2.2.2. 血清EPO、TNF-α检测
采用化学发光免疫分析法检测样本血清EPO、TNF-α浓度，试剂盒均购于德国Siemens公司。
2.2.3. 血清EPO分析
取血清EPO的对数log10EPO (lgEPO)进行数值转换，对Hb和EPO有相关性的组别进行Hb与lgEPO的简单线性回归分析，得到回归方程(lgEPO = 截距 + 斜率*Hb)。应用回归方程计算相应Hb水平下lgEPO预计值，并计算实测lgEPO/预计lgEPO(简写：O/P)。贫血患者的O/P < 0.80被视为EPO生成减弱 [8]，正常对照为1.01 ± 0.11 [9]。
2.2.4. 统计学分析
计量资料的统计描述采用均数 ± 标准差进行表示。多组间比较先经方差分析后采用SNK-q检验，不满足方差齐性假设是应用校正的Welch方差分析后采用Games-Howell检验。计量资料之间相关关系的研究采用Pearson相关分析。p < 0.05表示差异有统计学意义。应用SPSS24.0对数据进行统计分析。
3. 结果
3.1. 不同组别血清EPO水平变化
各组间血清EPO水平差异有统计学意义(F = 13.25, p < 0.05)。肿瘤贫血组血清EPO水平[(341.73 ± 314.00) IU/L]明显高于肿瘤非贫血组EPO水平[(86.00 ± 14.62) IU/L]及健康对照组EPO水平[(32.78 ± 45.12) IU/L] (p均<0.05)，但与非肿瘤贫血组[(235.26 ± 312.23) IU/L]比较差异无统计学意义。详见表1。
3.2. 不同组别血清EPO水平与Hb的相关性分析
肿瘤贫血组血清EPO与Hb呈负相关关系(r = −0.41, p < 0.01)；肿瘤非贫血组EPO与Hb相关性无统计学意义(r = −0.26, p > 0.05)；非肿瘤贫血组EPO与 Hb相关性无统计学意义(r = −0.21, p > 0.05)；健康对照组EPO与 Hb相关性无统计学意义(r = −0.14, p > 0.05)。
Table 1. Serum EPO and TNF-α levels in different groups ( χ ¯ ± s )
表1. 不同组别血清EPO、TNF-α水平(
)
注：与健康对照组、肿瘤非贫血组比较，*p < 0.05。
建立肿瘤品贫血组lgEPO与Hb的回归方程：lgEPO = 3.85 − 0.02Hb (R2 = 0.62, p < 0.05) (见图1)，lgEPO O/P 0.95 ± 0.28，有19.05% (8/42) O/P < 0.8。
Figure 1. lgEPO and Hb linear regression lines (black lines) in tumor anemia group and 90% forecast period (grey line) (R2 = 0.62, p < 0.05)
图1. 肿瘤贫血组lgEPO与Hb的线性回归线(黑色线)和90%预测期间(灰色线) (R2 = 0.62, p < 0.05)
3.3. 不同组别血清TNF-α水平变化
各组间血清TNF-α水平差异有统计学意义(F = 9.16, p < 0．05)。肿瘤贫血组血清TNF-α水平[(11.64 ± 9.19) pg/mL]明显高于肿瘤非贫血组TNF-α水平[(4.22 ± 2.52) pg/mL]及健康对照组TNF-α水平[(3.16 ± 0.75) pg/ml] (p均<0.05) (血清TNF-α正常参考范围：0~8.10 pg/mL)。
3.4. 不同组别血清TNF-α水平与Hb的相关性分析
肿瘤贫血组血清TNF-α与Hb呈负相关关系(r = −0.48, p < 0.05)；肿瘤非贫血组血清TNF-α与Hb相关性无统计学意义(r = −0.25, p > 0.05)；健康对照组血清TNF-α与Hb相关性无统计学意义(r = −0.19, p > 0.05)。
3.5. 不同组别血清TNF-α水平与EPO的相关性分析
肿瘤贫血组血清TNF-α与EPO及O/P相关性均无统计学意义(r = −0.16, p > 0.05; r = −0.24, p > 0.05)；肿瘤非贫血组血清TNF-α与EPO相关性均无统计学意义(r = −0.23, p > 0.05)；健康对照组血清TNF-α与EPO相关性均无统计学意义(r = −0.21, p > 0.05)。
4. 讨论
贫血，其表现是外周血RBC数减少或Hb浓度降低，是影响肿瘤患者预后的独立危险因素 [10]。恶性肿瘤患儿贫血严重程度可能与多种变量相关联，包括患儿的年龄、疾病的程度、性质和持续治疗的时间等。还有学者提出特定方面的营养缺乏、骨髓的肿瘤浸润及并发感染等因素也参与了贫血的发病过程 [11]。这些因素对于贫血是单独还是协同发挥作用目前尚不清楚。
EPO是一种调控红细胞生成的糖蛋白。据文献报道，肾功能正常的贫血患者EPO合成机制尚完整,血清EPO水平增高，其贫血机制与EPO水平无关 [12]。将单纯IDA患者做正常参照，成人CRA患者的EPO水平相对于前者是低的，说明CRA患者的EPO对贫血的反应是钝化的 [13]。故在本研究中，纳入包括IDA患者在内的其他非肿瘤性贫血病例。与EPO水平正常的健康对照组相比，CRA患者和非肿瘤性贫血患者EPO均是明显升高的，但两者比较无差异，不存在EPO的钝化，与Corazza等 [14] 的研究结果相似。但非肿瘤性贫血病例除5例IDA外，还有其他类型的贫血，其贫血对EPO的反应是否一致有待进一步研究。
有研究表明ALL贫血患儿血清EPO水平和Hb水平之间存在反比关系，并且可以通过反馈方式调节Hb水平 [15]。本研究中在肿瘤贫血组中发现了这种反比关系，并对EPO和Hb进行线性回归分析得到O/P，超过80%的病例O/P > 0.8，再次证明患儿EPO对贫血反应无钝化 [16]。本研究纳入对象均为肾功能正常者，其中有原发部位在肾脏的肿瘤如肾母细胞瘤患者5例，在贫血状态下有4例血清EPO水平是升高的，另有1例为一侧肾切除术后，其EPO无升高，O/P < 0.8，其贫血原因不能简单的归为EPO生成的缺乏，肾切除术可能与其发病相关。虽然CRA中EPO反馈性升高，但贫血无纠正。慢性炎症及营养代谢障碍对红细胞生成的抑制作用，可能与之有关。
ACD又名炎症性贫血，是由慢性感染、恶性肿瘤和自身免疫性疾病等因素引起，缓解期贫血可能是ACD的一种表现形式 [17]。这种炎症状态表现为CRP升高、体重减轻、低白蛋白血症和EPO抵抗性贫血，并涉及免疫、营养和代谢多种发病机制 [18]。炎症本身也可干扰营养状态，继而使贫血加重。炎症细胞因子如IL-1和TNF-α等，既可以抑制红系祖细胞的增殖，也钝化了血清EPO对Hb下降的正常反应，参与贫血的发生 [19]。TNF-α与炎症和肿瘤密切相关，在多种肿瘤微环境中均有表达，并被归类为肿瘤促进剂 [20]。本研究发现CRA中TNF-α与Hb两者呈负相关，说明TNF-α抑制了红细胞的生成。同时，TNF-α也可直接抑制EPO的生成 [21]。但也有研究表明EPO可通过巨噬细胞诱导一氧化氮合成酶抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的形成 [22]。但Tsopra等 [23] 在慢性淋巴细胞白血病中的证实，贫血的发生独立于EPO生成和刺激，可能是TNF-α对红细胞生成早期红系发育的直接抑制作用导致。本研究对CRA中EPO及O/P与TNF-α进行分析，均未发现相关性，与以上研究结果一致。
综上所述，在儿童肿瘤贫血患儿中，EPO和TNF-α均参与贫血的发生。内源性EPO对贫血的反馈性增生是充分的，TNF-α作为负向调控因子参与贫血的机制与抑制EPO产生无关，与成人研究结果相反 [24]。有必要进行更多研究了解儿童CRA中EPO和TNF-α之间的分子调节机制，更好地了解CRA的发病机制指导预防和治疗。
NOTES
*通讯作者。