1. 引言
传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)是一种经济上非常重要的鱼病病原体，在鲑科鱼类中能够引起严重的感染，导致高的死亡率 [1]。最初只在北美及欧洲的一些国家流行 [2]，近年来随着水生动物进口贸易的增加，传染性胰脏坏死病(infectious pancreatic necrosis, IPN)已传入我国，并在一些地区流行，对我国水产养殖业造成了严重的经济损失。目前，国内外对该病病原IPNV的检测方法虽已达到准确的诊断 [3]，但是很多方法耗时长、成本高 [4]。因此，需要建立一种针对IPNV的快速、有效、准确且适合野外现场操作的方法，以达到及早发现该病并进行隔离或扑杀，达到抑制疫病大规模暴发流行的目的。
2. 材料与方法
2.1. 毒株与试剂
IPNV (传染性胰脏坏死病毒)、IHNV (传染性造血器官坏死病毒)、SVCV (鲤春病毒血症病毒)、VHSV (病毒性出血性败血症病毒)和ISA (传染性鲑鱼贫血病毒)由本实验室分离保存；通用型RT-LAMP反应液试剂盒购自深圳博睿祥生物技术有限公司。
2.2. LAMP引物的设计
根据Genbank IPNV基因组中编码A片段多聚蛋白的核苷酸序列，使用Primer Explore V3和Primer Premier 5.0 软件针对目标序列的6个区域设计2对引物，即1对外引物，1对内引物。引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列见表1。
Table 1. Primers used for RT-LAMP detection IPNV
表1. IPNV RT-LAMP检测引物
2.3. LAMP反应条件的优化
IPNV RT-LAMP检测采用深圳博睿祥生物技术有限公司的通用型RT-LAMP反应液试剂盒，按照试剂盒操作，反应体系为25 μL，加入的组分剂量如表2：
Table 2. Reaction system of IPNV RT-LAMP
表2. IPNV RT-LAMP反应体系
按照上述反应体系对IPNV RT-LAMP的扩增条件进行优化，采用相同模板、相同的组份配置，分别在不同的温度下(
60 ℃
、
61 ℃
、
62 ℃
、
63 ℃
、
64 ℃
和
65 ℃
)恒温反应60 min，以确定最佳反应温度；采用相同模板、相同的组份配置，在优化的温度下分别恒温反应30 min、45 min、60 min、75 min和90 min，以确定最佳反应时间。
2.4. LAMP结果判定
扩增结果使用3种方法进行观察。
方法1：通过琼脂糖凝胶电泳判读结果。
方法2：通过观察荧光颜色变化判读结果(荧光显色法)。
方法3：通过检测浊度变化判读结果。
2.5. LAMP的特异性试验
参照商品化核酸提取试剂盒方法(Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0)，提取IPNV (传染性胰脏坏死病毒)、IHNV (传染性造血器官坏死病毒)、SVCV (鲤春病毒血症病毒)、VHSV (病毒性出血性败血症病毒)和ISA (传染性鲑鱼贫血病毒)的RNA作为模板进行RT-LAMP反应，验证RT-LAMP引物的特异性。
2.6. LAMP的灵敏度试验
取IPNV病毒悬液200 μL，提取病毒RNA，作十倍系列稀释，取每个梯度稀释液1 μL作为模板进行RT-LAMP，确定建立RT-LAMP检测方法的灵敏度。
3. 结果与讨论
3.1. LAMP方法反应温度的确定
对IPNV RT-LAMP反应温度进行优化，从反应完成的反应管中取8 μL进行凝胶电泳，电泳结果表明，在
60 ℃ ~
65℃的温度范围内，特征电泳条带在
62 ℃
时最亮(图1)。因而可以确定
62 ℃
是IPNV RT-LAMP的最适反应温度。
M：DL2000 Marker；1：
60 ℃
；2：
61 ℃
；3：
62 ℃
；4：
63 ℃
；5：
64 ℃
；6：
65 ℃。
Figure 1. Electrophoresis map for the IPNV RT-LAMP product for 60 min
图1. IPNV RT-LAMP各温度扩增60 min凝胶电泳结果
3.2. LAMP方法反应时间的确定
在
62 ℃
恒温条件下，分别进行不同反应时间的IPNV RT-LAMP试验，反应结束后，将各扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图2所示，在45~90 min时间范围内，均能看见梯状特征条带，但IPNV RT-LAMP反应条带最亮的为45 min时所产生的。因此确定IPNV RT-LAMP反应的最佳条件为
62 ℃
恒温反应45 min。
M：DL2000 Marker；1：30 min；2：45 min；3：60 min；4：75 min；5：90 min。
Figure 2. Determination of the optimal time for the RT-LAMP
图2. IPNV RT-LAMP反应时间的优化
3.3. RT-LAMP反应结果判定方法
方法1：通过琼脂糖凝胶电泳判读结果：取扩增产物8 μL进行凝胶电泳，紫外投影下观察，靠近点样孔出现拖尾，远离点样孔出现梯度条带的样品判为阳性，阴性对照中，反应后反应液未显示有扩增条带。
方法2：通过观察荧光颜色变化判读结果(荧光显色法)：在反应管中加入双链DNA (dsDNA)染料Pico Green，阳性样品中，反应后的反应液显示绿色荧光，阴性对照中，反应后的反应液显示浅橙色荧光。
方法3：通过检测浊度变化判读结果：反应温度为
65 ℃
，从反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪(厂家：日本荣研化学株式会；型号：LA
-320C
；参数：光源为ED (波长650 mm)，检出器为光电二极管，温度调节范围为区域(55℃~70℃)、光罩(65℃~90℃)，测定间隔为6秒)检测反应液，实时检测60分钟。
LAMP浊度仪检测图见图3(C) (横坐标1为阳性反应管；横坐标2为阴性对照管；当反应为阳性扩增时候模块的颜色转变为红色，如果未发生扩增，则模块的颜色仍旧为绿色)。
将1个阳性样品和一个阴性样品按优化后的RT-LAMP反应程序进行反应，通过以上三种方法来判定RT-LAMP反应结果(结果如图3)。结果表明，用这三种方法判定RT-LAMP的扩增产物，其结果是一致的，阳性和阴性之间的区别十分明显，可以把这三种方法作为RT-LAMP扩增结果判定的方法。
Figure 3. Result determination of IPNV RT-LAMP
图3. IPNV RT-LAMP结果判定
3.4. LAMP引物组合物的特异性试验
提取IPNV (传染性胰脏坏死病毒)、IHNV (传染性造血器官坏死病毒)、SVCV (鲤春病毒)、VHSV (病毒性出血性败血症病毒)和ISA (传染性鲑鱼贫血症病毒)的RNA作为模板进行RT-LAMP反应，进行RT-LAMP特异性试验，结果表明，该LAMP引物组合物只对IPNV进行了特异性的扩增，与其他病毒无交叉反应，结果见图4。
M：Maker DL2000；1：IPNV；2：IHNV；3：SVCV；4：VHSV；5：ISA；6：Negative control。
Figure 4. Specificity for detection of IPNV by RT-LAMP
图4. IPNV RT-LAMP 检测的特异性试验
3.5. LAMP引物组合物的灵敏度试验
利用本研究中得到的最佳反应条件对人工感染带有典型病症的病鱼样品提取的RNA进行扩增，10倍稀释RNA进行RT-LAMP灵敏性试验，检测结果如图5所示，随着模板RNA浓度的降低，特征性条带的亮度也减弱，检测结果为阳性的最大稀释度为10−8，相应的灵敏度为0.01 pg RNA。
M：Marker DL2000；1：100；2：10−1；3：10−2；4：10−3；5：10−4；6：10−5；7：10−8；8：10−9。
Figure 5. Sensitivity for detection of IPNV by RT-LAMP
图5. IPNV RT-LAMP的灵敏度试验
3.6. 样本检测
收集沈阳、本溪、丹东、朝阳、葫芦岛、东港等地区的60份样品，同时采用RT-LAMP方法和常规的PCR方法进行检测。检测结果见表3。结果表明：11份样品采用RT-LAMP方法和PCR方法检测均为阳性；47份样品均为阴性；1份样品PCR检测为阳性，RT-LAMP检测为阴性；1份样品经PCR检测为阴性，经RT-LAMP方法检测为阳性。由此可计算出：本研究建立的RT-LAMP方法灵敏度为：11/(11 + 1) × 100% = 91.67%，特异性为：47/(47 + 1) × 100% = 97.92%，与常规PCR方法的符合率为：(11 + 47)/60 × 100% = 96.67%。这些数据表明，IPNV RT-LAMP方法具备良好的特异性和敏感性，适用于传染性胰脏坏死病毒的检测及疫病诊断。
Table 3. Results of clinical samples
表3. 临床样本检测结果
4. 讨论与结论
本研究建立的针对IPNV的RT-LAMP检测技术，经试验结果显示，IPNV RT-LAMP特异性良好，与IHNV (传染性造血器官坏死病毒)、SVCV (鲤春病毒)、VHSV (病毒性出血性败血症病毒)和ISA (传染性鲑鱼贫血症病毒)均无交叉反应，只与目标病原IPNV (传染性胰脏坏死病毒)有扩增反应；灵敏度试验显示，IPNV RT-LAMP技术检出低限为0.01 pg IPNV RNA，具备较高的灵敏性，适用于水生动物疫病传染性胰脏坏死病的检测与监测。
在LAMP反应体系中，包括模板在内的各反应组分浓度都应该维持在一定合理范围内，进而保持整个反应体系的平衡。如果模板浓度过高，其LAMP反应的其他原料(包括Bst DNA聚合酶，反转录酶，2×反应缓冲液(RM)，正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP及反向内引物BIP)分配于每块模板(RNA模板)的量相对就低很多，有时候甚至要很多模板去竞争一份原料。当进行LAMP反应时，就会很容易出现非特异性扩增，从而出现假阳性结果。灵敏性试验表明，应用LAMP技术可检测出IPNV RNA在1.0 μg的模板含量。由于水生动物疫病病原感染特点，水生动物病毒在宿主中的含量不会很高，本研究建立的RT-LAMP方法的1.0 μg IPNV RNA模板含量已经超出了实际样品中IPNV的感染量，所以，利用本LAMP方法，无需对待检样品的RNA浓度进行调整，样品RNA提取后，直接进行LAMP反应即可，既提高了反应效率，又加快了反应速度，更适合现场及野外样品的检测，符合了LAMP技术本身具备的反应快速简便的特点，检测结果可通过颜色变化即可做出判断，本研究建立的IPNV RT-LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便、易于判断的特点，适用于基层单位及野外现场快速检测，为传染性胰脏坏死病毒的检测与诊断增添了重要的技术手段。
基金项目
辽宁省自然科学基金项目(20180551285)、原国家质检总局科研项目(2015IK165)、(2016IK156)。
NOTES
*通讯作者。