摘要:
HDS属于GcpE蛋白家族，具4Fe-4S活化中心。植物HDS既是萜类物质前体IPP合成的关键酶，也是单萜和双萜类芳香物质、类胡萝卜素、VE和叶绿素等重要物质合成的关键调控位点。其催化调节的MEP途径所合成的萜类化合物对于植物传粉、对抗天敌、代谢调控等方面具有重要作用。本文主要从基因克隆、基因功能以及基因表达特性比较三个方面来分析比较不同植物MEP途径中的HDS基因，以期深入了解该基因对萜类化合物合成的作用。
Abstract:
HDS belongs to GcpE protein family, with 4Fe-4S activation center. HDS is the key enzyme of terpenoid substances precursor IPP synthesis, monoterpene and double terpenoids aromatic substances, carotenoids, VE and important material such as chlorophyll synthesis of key control site. The MEP pathways that regulate the catalysis of synthesis of TIAs for pollinating plants against predators, metabolic regulation plays an important role in such aspects, the HDS for cloning genes and carries on the correlation analysis to study the effect of the synthesis of TIAs has great significance. In this paper, HDS genes in MEP pathway were compared among different plants from gene cloning, gene function and gene expression characteristics mainly to try to understand the role of HDS gene playing in MEP pathway.
1. 引言
MEP途径又称质体途径(plastid pathway)，存在于真细菌以及进行光合作用的生物中(如高等植物、藻类、光合细菌等)。该途径产生的萜类吲哚生物碱是类异戊二烯生物合成的前体物质。类异戊二烯及其衍生物在生物代谢和细胞壁合成中至关重要，目前许多植物类异戊二烯化合物如有价值次生代谢产物香精油、药品、膳食补充剂、生物聚合物和农药已被广泛应用于工业、医药和农业。MEP途径中HDS蛋白是植物萜类物质合成MEP途径中催化第六步反应所需的酶，催化ME-cPP转化生成HMBPP，最后生成IPP和DMAPP后经异戊烯基转移酶类的延伸反应以及萜类合酶的修饰作用，合成种类繁多且功能各异的萜类化合物。本文拟对植物中克隆出的HDS基因及其功能进行比较，以期了解该基因在不同植物MEP途径中作用的特性，丰富对HDS基因及其功能的认识。
2. 不同植物HDS基因的克隆与序列分析
2.1. 不同植物中分离克隆的HDS基因
植物、藻类、微生物均具有HDS基因。系统进化分析表明，三者的HDS基因分属不同的分支。目前已经从黄花蒿、多花水仙等多种被子植物中克隆出HDS基因 [1] - [10] (表1)，其中既有单子叶植物，也有双子叶植物；既有草本植物，也有木本植物；既有一年生植物，也有多年生植物，说明由HDS基因调节的MEP途径广泛存在于被子植物中。亲缘关系分析表明HDS基因在同科同纲植物中亲缘关系最近(表2)。
Table 1. Phytogroups in which the HDS genes were cloned till now
表1. 目前克隆获得HDS基因的植物类群
Table 2. Evolutionary relationship of HDS genes among different plants
表2. 不同植物中HDS基因进化关系
2.2. 不同植物中HDS基因序列与蛋白质结构特征
比较不同植物HDS基因发现，HDS基因的序列长度一般都在2000~3000 bp，开放阅读框长度大多约为2200 bp，生物信息学预测HDS基因编码氨基酸在740个左右(表3)。
Table 3. Characteristics of HDS gene and protein in different plants
表3. 不同植物中HDS基因序列与蛋白结构特征
HDS蛋白在不同植物中的理化性质比较一致。蛋白N端比藻类和细菌多大约80个氨基酸残基。重要的是，HDS蛋白序列中均预测出在质体转运中发挥作用的转运肽序列 [1]。植物HDS蛋白的氨基酸序列中含有3个高度保守的半胱氨酸位点，被认为可能是蛋白转运金属离子结合位点的一部分 [2]。多序列比对得出萝芙木和茶树的3个半胱氨酸残基活性位点分别处于不同位置 [2] [4]，茶树CsHDS中相应位置为CsHDS-632、CsHDS-644、CsHDS-647，而萝芙木RvHDS中相应位置为Cys-644、Cys-647、Cys-678。HDS蛋白二级结构中以α螺旋、β-折叠和β-转角较多，一般地，α-螺旋是HDS蛋白多肽链中比较丰富的结构元件，散布于整个肽链。成熟蛋白序列具有2个保守结构域——N端的延伸区域PSN和约30 KD的中心结构域PSI [11]。HDS晶体结构分析显示了HDS蛋白中的4Fe-4S活性中心蛋白与底物的结合位点 [12]。
2.3. 不同植物HDS基因克隆技术上的差异
在黄花蒿、萝芙木等已有报道中可知HDS基因的cDNA全长克隆均采用RT-PCR和RACE技术 [1] - [9]，但对于第一步提取RNA的技术有所不同，黄花蒿、萝芙木、茶树、多花水仙、铁皮石斛、毛果杨中使用多种RNA提取试剂盒提取RNA [1] [2] [4] [6] [7] [8]，对杜仲则使用改良的CTAB-LiCl法提取 [3]，而白花丹参利用Trizol试剂提取 [5]。新塔花的研究中借助了转录组数据库的相关信息 [10]。
3. 不同植物HDS基因功能的多样性
3.1. 不同植物HDS基因表达特性
实时荧光定量PCR测定分析表明，不同植物中HDS基因表达具有组织器官差异。茶树中HDS的表达量在成熟叶中最高，嫩茎中最低，这与在萝芙木、新塔花中发现的规律相似 [1] [10]。铁皮石斛DoHDS在茎中表达量最高，说明了同一基因在不同植物中，基因表达量不同；在同一植物不同组织中，基因表达量亦不相同 [7]。多花水仙中，盛花期HDS基因无论是在花瓣还是副冠中的表达量都明显高于花蕾期，推测NtHDS表达水平的高低可能与花香物质的合成量有关 [6]。茉莉酸甲酯(MeJA)和紫外(uv)可使得MEP途径中HDS上游的一个诱导子——MECs酶基因的表达上调，但包含茉莉酸甲酯(MeJA)、紫外(uv)、脱落酸(ABA)和丙烯腈(ASA)在内的诱导子对于HDS基因的表达均无直接影响。因此，需进一步研究能够使HDS表达上调的诱导子，再利用基因工程的手段，以期增加萜类化合物的产量。
3.2. 不同植物HDS基因功能的比较
植物体通过MEP途径合成各种对人类工业、农业、医药起重要作用的萜类物质，其对生物自身生长发育也非常关键，HDS在植物中的功能主要是调节MEP途径，影响萜类化合物的产量，但是在不同植物中的功能具有多样性，如参与植物防御和早期发育调节等，具体见表4。
Table 4. HDS gene functions in different plants
表4. 不同植物HDS基因的功能
4. 讨论
本研究比较分析表明，从黄花蒿等多种植物中分离克隆的HDS基因序列有较高的同源性，但功能具有多样性。已知大肠杆菌HDS基因是生长必需基因 [13]，植物HDS基因除作为萜类化合物MEP合成途径中的关键酶基因 [14]，还具有参与植物防御等作用，其基因表达模式和调控特征尚需通过实验进一步了解。
5. 展望
萜类化合物是植物中比较丰富的次生代谢产物，对HDS基因及其功能的认识将有利于深入了解萜类化合物合成的机制和调控特征，为进一步促进药用植物的利用提供理论支撑。
NOTES
*通讯作者。