摘要:
中国是世界上缺硒最严重的国家之一，约7亿人处在硒营养不足状态。因此，研究和应用外源补硒技术，提高农产品尤其是主粮的硒含量，对非富硒地区而言显得尤为重要。农产品硒含量的测定是富硒技术研发的重要环节，目前我国以氢化物–原子荧光光谱法为首选检测方法(GB5009.93-2017)，本研究以富硒稻米为对象，分析和探讨了原子荧光光谱法中广泛应用的三种湿发消解方法(A、B、C)对稻米硒含量检测结果的影响。研究表明：1) 原子荧光光谱法采用不同湿法消解方法检测的稻米硒含量的变异系数(CV)，处理B的CV平均数最小，整体上说明该方法的稳定性较好。2) 以三种湿法消解方法的稻米硒含量总平均值0.926 mg/kg为参照，我们初步认为，以“硝酸 + 高氯酸酸系、80℃ (60 min)-升温至100℃ (60 min)-升温至130℃(60 min)消解升温流程、190℃赶酸温度”(处理C)，具有较高的准确性。3) 同一家检测机构对三种湿法消解方法的检测结果存在显著(P < 0.05，下同)或极显著差异(P < 0.01，下同)，说明不同的湿法消解方法对原子荧光光谱法的检测结果具有重要影响。4) 同一种湿法消解方法三家检测机构的检测结果均存在极显著差异，说明硒检测的准确性除了湿法消解方法影响因素外，还存在某些操作细节因素的影响，除了可能存在的检测设备差异外，更重要的是与操作的精准性有关，这一情况应引起检测行业的高度重视，建议在检测标准制(修)定中应进一步细化操作流程。
Abstract:
China is one of the most serious selenium deficient countries in the world, and about 700 million people are in the state of selenium deficiency. Therefore, the research and application of exogenous selenium technology to improve the selenium content of agricultural products, especially the main grain, is particularly important for non-selenium rich areas. The determination of selenium content in agricultural products is an important link in the research and development of selenium rich technology. At present, hydride generation atomic fluorescence spectrometry (HG-AFS) is the preferred detection method in China (GB 5009.93-2017). In this study, the effects of three wet digestion methods (A, B, C) widely used in atomic fluorescence spectrometry (AFS) on the detection results of selenium content in rice were analyzed and discussed. The results showed that: 1) The coefficient of variation (CV) of rice selenium content detected by Atomic Fluorescence Spectrometry with different wet digestion methods was the smallest, indicating that the method was stable on the whole. 2) Taking the total average value of selenium content of rice by three wet digestion methods as reference, we preliminarily believe that the process of “nitric acid + perchloric acid system, 80˚C (60min)-heating to 100˚C (60 min)-heating to 130˚C (60 min), and 190˚C acid driving temperature” (treatment C) has high accuracy. 3) There were significant differences (P < 0.05, the same below) or very significant (P < 0.01, the same below) between the three wet digestion methods in the same testing institution, which indicated that different wet digestion methods had an important impact on the detection results of atomic fluorescence spectrometry. 4) For the same wet digestion method, there are significant differences in the test results of three testing institutions, which indicate that the accuracy of selenium detection is affected by some operation details besides the influencing factors of wet digestion method. In addition to the possible differences of detection equipment, the more important thing is the accuracy of operation. This situation should be highly valued by the testing industry. It is suggested that the operation process should be further refined in the preparation (Revision) of testing standards.
1. 引言
硒于1973年被确定为人体必需的微量元素 [1]，具有提高人体免疫力、防止脂质过氧化、消除重金属积累危害、帮助机体抵御病毒感染等生理生化功能 [2] - [17]。长期食用低于0.1 mg/kg的含硒食物会导致人体硒缺乏反应症，长期食用硒高于1 mg/kg的食物则可能会引起硒中毒 [2]。根据中国营养学会所作的营养调查报告表明，我国大部分地区属于缺硒地区，仅靠天然食物中的硒不足以满足人体的正常需要 [18]。因此，近年来各地加大了富硒农产品的研发力度。根据2018年4月1日实施的中华人民共和国卫生行业标准WS/578.3-2017《中国居民膳食营养素参考摄入量第3部分：微量元素》，成人日硒营养摄入量为400 μg/d > p ≥ 60 μg/d。据此，阳静等 [19] 以膳食硒含量、日膳食量和人体血硒含量为特征指标，提出了“配方补硒”的重要理念与方法，探讨了发展超高含量富硒农产品的重要性，进一步拓展了对富硒农产品的认识与应用空间，为科学补硒提供了重要参考。
硒测定方法的研究始于20世纪90年代，目前我国食品硒含量测定主要采用GB5009.93-2017 (食品安全国家标准–食品中硒的测定)标准，该标准以氢化物–原子荧光光谱法为第一法、荧光分光光度法为第二法、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)为第三法。由于氢化物–原子荧光光谱法操作简便，且灵敏度高，被认为是国标测硒中的首选方法。氢化物–原子荧光光谱法的关键环节是湿法消解，而国家标准并未对消解升温程序和赶酸温度等操作流程作出详细规定。调查发现，在实际检测工作中各检测机构采用的湿法消解方法存在较大差异，而这种差异可能会影响到检测结果，但目前尚未见相关研究报道。本研究旨在通过采用几种主流的湿法消解方法，由多家检测机构对同一富硒稻米样品同时进行检测，并对检测结果进行统计分析，以验证不同湿法消解方法对稻米食品硒含量检测结果的影响，为富硒农产品技术研发与生产应用的精准检测服务提供科学依据。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
供试样品：2019年稻鸭共作模式生产的富硒稻米(精米)，由株洲香之优农业科技发展有限责任公司提供。
检测机构：三家专业检测机构参与本研究，分别编号为J1公司、J2公司、J3公司。
取样方法：由专家组成员共同现场取样与分样，每种湿法消解方法均设置5个平行，由上述专业检测机构独立完成检测。
2.2. 试验设计
采用GB5009.93-2017氢化物–原子荧光光谱法，设计三种湿法消解处理方式，处理A：所用酸系“硝酸+双氧水”，消解升温程序：110℃ (150 min)升温至160℃ (120 min)，赶酸温度：160℃；处理B：所用酸系“硝酸+高氯酸”，消解升温程序：100℃ (90 min)-升温至120℃ (60 min)，赶酸温度：160℃；处理C：所用酸系“硝酸+高氯酸”，消解升温程序：80℃ (60 min)-升温至100℃ (60 min)-升温至130℃ (60 min)，赶酸温度：190℃。以电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)为对照(处理D)。尽管在GB5009.93-2017氢化物–原子荧光光谱法的湿法消解处理中规定使用铁氰化钾，但在实践中发现使用铁氰化钾存在一定的弊端，因此本试验中专家组一致确认不使用铁氰化钾。
2.3. 数据处理
试验数据采用Excel 2003进行数据整理和方差分析，采用Excel的TDIST函数进行多重比较(LSD)，采用变异系数(CV)分析检测方法的稳定性。
3. 结果与分析
3.1. 检测数据的有效性分析
由表1可知，各检测机构采用不同检测方法测得的稻米硒含量，样本标准差在0.012~0.062，且任一两次独立测定结果的绝对差值与其平均数的比值为3.4%~15.6%，满足在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值20%的要求，说明重复性较好，检测结果有效。
Table 1. Test results and validity analysis table of selenium content in rice (mg/kg)
表1. 稻米硒含量检测结果与有效性分析表(mg/kg)
3.2. 不同检测机构的数据分析
由表2、表3、表4可知，三家检测机构的检测结果在不同处理间均存在极显著差异(P < 0.01，下同)。多重比较表明，J1公司处理D (ICP-MS方法)的硒含量最高，极显著高于其它处理；处理B和C均极显著高于处理A，但B、C间无显著差异。J2公司处理D (ICP-MS方法)的硒含量最高，极显著高于其它处理；处理A显著高于处理B (P < 0.05，下同)、极显著高于处理C；处理B极显著高于C处理。J3公司处理B的硒含量最高，极显著高于处理A，但与处理C间无显著差异；处理C极显著高于处理A。
Table 2. Analysis of variance of test results of rice selenium content by J1 company
表2. 稻米硒含量J1公司检测结果方差分析表
注：**表示方差分析达极显著水平(P < 0.01)，*表示方差分析达显著水平(P < 0.05)，下同。
Table 3. Variance analysis of test results of rice selenium content J2 company
表3. 稻米硒含量J2公司检测结果方差分析表
Table 4. Variance analysis of test results of rice selenium content J3 company
表4. 稻米硒含量J3公司检测结果方差分析表
3.3. 不同检测方法的数据分析
采用湿法消解方法A (处理A)，不同检测机构测得的稻米硒含量存在极显著差异(表5)，其中：J2公司 > J3公司 > J1公司，J2公司检测值极显著高于J1公司和J3公司，而J1公司和J3公司之间差异不显著。采用湿法消解方法B，不同检测机构测得的稻米硒含量存在显著差异(表6)，其中：J2公司 > J3公司＞J1公司，且相互之间在P = 0.01水平上均有统计学意义。湿法消解方法C，不同检测机构测得的稻米硒含量存在显著差异(表7)，其中：J1公司 > J3公司 > J2公司，J1公司和J3公司检测值极显著高于J2公司，而J1公司和J3公司之间差异不显著。采用ICP-MS方法，不同检测机构测得的稻米硒含量间无显著差异(表8)，平均稻米硒含量较原子荧光光谱法的湿法消解方法A、B、C分别高19.27%，14.68%、17.47%，说明ICP-MS方法的检测结果偏高。因此，在富硒农产品技术研发的检测工作中，以采用原子荧光光谱法较好。
Table 5. Variance Analysis of rice selenium content in wet digestion method A
表5. 湿法消解方法A的稻米硒含量方差分析表
Table 6. Variance Analysis of rice selenium content in wet digestion method B
表6. 湿法消解方法B的稻米硒含量方差分析表
Table 7. Variance Analysis of rice selenium content in wet digestion method C
表7. 湿法消解方法C的稻米硒含量方差分析表
Table 8. Variance analysis of selenium content in rice by ICP-MS
表8. ICP-MS方法的稻米硒含量方差分析表
A、B、C三种湿法消解方法的稻米硒含量分别为0.909 mg/kg、0.946 mg/kg、0.923 mg/kg，总平均值为0.926 mg/kg。由于上述三种方法均为实际检测中常用的方法，如果以总平均值0.926 mg/kg估算为真值，而处理C的平均值与之基本相同或最为接近，故此，可以认为湿法消解方法C的检测结果更接近真值。
3.4. 检测方法的稳定性分析
原子荧光光谱法采用不同湿法消解方法检测的稻米硒含量的变异系数(CV)，可在一定程度上反映检测方法的稳定性，同时也说明了检测机构对某种方法的熟练或精准控制程度。由表9可知，处理B的CV平均数最小，整体上说明该方法的稳定性较好；C处理的CV值中，J2公司与J3公司基本一致，但J1公司检测的CV值明显偏高，说明J1公司在使用该方法时存在操作细节上的问题；A处理CV值J2公司很小，而J1公司和J3公司基本一致且较大，说明在使用该方法时J2公司把握得更精准。
Table 9. Variation coefficient of selenium content in rice samples
表9. 稻米样本硒含量变异系数分析表
4. 讨论与结论
在日常硒元素的检测服务中，各检测机构都是执行国家有关检测标准，但在原子荧光光谱法的湿法消解方法上存在一定的差别，如本研究中A、B、C三种湿法消解方法分别来自不同检测机构主要的使用方法。本研究表明，不同检测机构采用同一种湿法消解方法对稻米硒含量的检测结果具有显著差异，其中：J2公司处理方法A、B的硒含量值均最高，而处理C方法最低；J1公司处理A、B方法的硒含量值均最低，而处理C方法最高；J3公司三种处理方法的硒含量值排序均居中。出现这种差异的原因，除了可能存在的检测设备差异外，更重要的是与操作的精准性有关。其所以特别强调操作的精准性，是因为在组织本次联合研究之前，曾对同一批产品送4家检测机构分别进行检测，其稻米硒含量数据差异非常大(表10)。表10中的检测“机构4”采用的原子荧光光谱法，其湿法消解方法与本试验中的处理C方法相同，但检测数据较本试验处理C低73%；而采用ICP-MS方法的三家检测机构的稻米硒结果(同一个样品)，“机构1”较本试验高27%，“机构2”和“机构3”分别较本试验低27%、19%，这种差异对于科学研究而言是不可接受的。因此，在食品硒含量检测中，进一步细化操作流程至关重要。
Table 10. Test results of selenium content in Rice by four testing institutions
表10. 四家检测机构对稻米硒含量的检测结果
通过三种湿法消解方法检测稻米硒含量的对比研究，我们初步认为，采用“硝酸 + 高氯酸”酸系、80℃(60 min)-升温至100℃ (60 min)-升温至130℃ (60 min)消解升温流程、190℃赶酸温度，具有较高的准确性。
NOTES
*通讯作者。