虫纹鳕鲈Maccullochella peelii染色体核型分析

Karyotype of the Maccullochella peelii

摘要: 采用PHA体内直接注射法制备了虫纹鳕鲈(Maccullochella peelii, Mitchell)染色体标本，经空气干燥法，Giemsa染色后，观察虫纹鳕鲈的染色体核型和特征，结果表明，虫纹鳕鲈染色体数目为48条，2n = 48所占的观察分裂相中的比例为82%；核型公式为：2n = 2sm + 10st + 36t，染色体臂数(NF)为50，其染色体相对长度范围为(5.40 ± 0.02)~(2.56 ± 0.01)，未发现与性别相关的异型染色体。通过比较分析，虫纹鳕鲈属于高位类类群。本研究为麦鳕鲈属鱼类的细胞遗传学研究提供了重要资料，并为其种子资源的保护及人工繁育育种等奠定基础。

Abstract: Metaphase of kidney cells was collected to study the karyotype of Murray Cod by in vivo injection of PHA and colchicine, chromosome samples were obtained by using the olchicine-air drying technique, and Giemsa staining. The results showed that the diploid chromosome number of Murray Cod was 48, and 82 spreads showed 2n = 48 chromosomes, which represented 82% of the observed metaphase. The karyotypic formulae are 2n = 2sm + 10st + 36t and NF = 50. The relative length of chromosome was in the range of (5.40 ± 0.02) - ( 2.56 ± 0.01), and the sex chromosome were not found in this species. The comparison of karyotyaes suggested that M. peelii might belong to an advanced and specific evolutionary group. Our study will promote the understanding of the cytogenetic research of the genus Maccullochella, and lay the foundation for the protection of germplasm resources and artificial breeding.

1. 引言

虫纹鳕鲈(Maccullochella peelii, Mitchell)，隶属于鲈形目，鮨鲈科，麦鳕鲈属，俗称虫纹麦鳕鲈、墨瑞鳕、澳洲龙纹斑，是澳大利亚乃至世界上种群类型较大且非常名贵淡水经济鱼类之一，主要分布于墨瑞河及达令河流域。其具有生长速度快，繁殖能力强，一年可达200克，三年到达2公斤 [1]；其经常在水域边缘游动，主要以水中小鱼、小虾为主，有时可摄食水鸟、蛙类及水老鼠等 [2]。虫纹鳕鲈肉质鲜嫩、口感细滑，肌间刺较少，其肌肉富含高含量的蛋白质及不饱和脂肪酸，且氨基酸种类齐全，尤其是富含4种香味氨基酸及人体必需氨基酸，具有较高的营养价值 [3]。近几年，我国不断引进澳洲龙纹斑并开发驯化，逐渐成为了我国一项新兴的水产养殖产业。目前，很多研究对澳洲虫纹鳕鲈的生活习性、遗传多样性、肌肉营养成分及疾病防控等进行了系统研究，探明了其生物学和种质特性 [2] [4] [5] [6] [7]；研发了澳洲虫纹鳕鲈的生态模拟人工繁殖、控光苗种驯化培育等相关技术，形成了成熟的人工繁育及配套养殖技术 [8] [9] [10]。而在其在细胞遗传学方面的研究比较空白。近几十年来，细胞遗传育种作为一种新兴的繁育技术，开始应用到鱼类杂交育种上，为苗种的改良、提纯及新品种的开发发挥了重要的作用。虫纹鳕鲈作为我国新引进的淡水养殖品种，全面研究其细胞遗传学参数至关重要。因此本文对虫纹鳕鲈雌雄个体的染色体核型进行解析，旨在了解其繁殖遗传特性，为其种质资源的开发与利用以及演化地位的研究提供理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 材料

实验虫纹鳕鲈购自江苏中洋集团养殖基地，应用拖网共获取3尾雌鱼及2尾雄鱼，全长为22.15 ± 1.24 cm，体重为550.62 ± 80.47 g。暂养于1吨水泥池中，养殖用水为暴晒3天的地下井水，水温保持在22.00 ± 1.00℃，溶解氧保持在6.5 mg/L以上。

2.2. 实验方法

2.2.1. 虫纹鳕鲈染色体标本制备

虫纹鳕鲈染色体标本制备参考林义浩的方法 [11]，并略加修改。将植物凝集素(PHA)以鱼体重8 μg/g的剂量直接胸鳍基部注射，12 h后再次注射同等剂量的PHA，效应6 h后将秋水仙素以鱼体重5 μg/g的剂量进行注射，3 h后立即MS222麻醉，冰盘上解剖，迅速取鳃基部两侧头肾组织，于0.9%生理盐水中冲洗2~4次，冲洗好的样品于0.075 mol/L的KCl溶液低渗处理45 min，将样品加入到预先配制新鲜的Carnoy氏液(甲醇和冰醋酸按体积3:1配制)中固定15 min，更换固定液重复固定2次，−20℃冰箱保存。

取出固定好的样品组织，剪取少量于10 ml烧杯中，滴加5~10滴30%的冰醋酸进行组织解离，反复剪碎，再加入50 ul固定液，摇匀，于300目筛绢网中过滤收集细胞悬液备用。应用5 ml细长玻璃吸管吸取悬浮液滴加到经无水乙醇预冷的载玻片上，迅速过酒精灯，待燃烧完后自然干燥。染色体玻片使用10%吉姆萨染液(吉姆萨母液：双蒸水按体积1:9进行配置)染色35 min，室温干燥后保存备用。

2.2.2. 虫纹鳕鲈核型分析

制作的染色体玻片应用光学显微镜(NIKON YS100)进行观察拍照。选取中期分裂较好、形态清晰、大小适中且染色体单体分散的细胞分裂相进行染色体众数统计、臂长测量等。染色体分类采用Levan等 [12] 方法。

3. 结果

3.1. 虫纹鳕鲈染色体数目

本研究选取100个(雌性50个，雄性50个)染色体中期分裂相的结果见表1。由表1可知，虫纹鳕鲈中期分裂相染色体数目最多的为48，含有87个，占所有统计细胞数目的82%。可见，虫纹鳕鲈二倍体染色体众数是48，即2n = 48。

Table 1. Number frequency of chromosome in Maccullochella peelii

表1. 虫纹鳕鲈染色体数目分布

3.2. 虫纹鳕鲈染色体组型分析

选取20个(雌鱼10个，雄鱼10个)形态清晰的中期分裂相进行拍照、测量并分析，结果表明，虫纹鳕鲈共有24对同源染色体，染色体相对长度范围在5.63~2.79 um之间，雌雄鱼在染色体核型组成上无差异，且无与性别相关的异型染色体及次缢痕(见表2)。20个分裂相形态表明，虫纹鳕鲈染色体可分为3组，sm类型有1对，st类型共5对，t类型共18对，其核型公式为：2n = 2sm + 10st + 36t，NF = 50 (见图1和图2)。

Figure 1. Metaphase chromosomes of Maccullochella peelii (100×)

图1. 虫纹鳕鲈染色体中期分裂图(×100倍)

sm.亚中部着丝点染色体；st.亚端部着丝点染色体；t.端部着丝点染色体

Figure 2. Karyotype of Maccullochella peelii (100×)

图2. 虫纹鳕鲈核型(×100倍)

Table 2. The relative length and arm ratio of chromosomes in Maccullochella peelii

表2. 虫纹鳕鲈各染色体的相对长度和臂比值

4. 讨论

染色体核型分析是细胞遗传学研究的基本方法，在鱼类中开展染色体核型分析不仅能够了解其演化地位，分类系统以及染色体的形态，还能够为以后鱼类的杂交育种提供一定的遗传学依据。目前很多研究表明了具有48条单臂染色体核型是硬骨鱼类的最原始的核型组成，随着生活及地理环境的不断更替，物种间核型呈现了多态化，而这种多态化基本上是由于染色体的多倍化或罗伯逊易位所引起的，导致了物种间的隔离，在一定程度上造就了物种的多样性 [13] - [18]。在本研究中虫纹鳕鲈的染色体数目为48，核型为2n = 2sm + 10st + 36t (NF = 50)，可见，虫纹鳕鲈在其生活演化史中核型复杂化、臂数增多。另外，周剑光对新疆江鳕研究发现，其通过增加其染色体臂数以适应淡水生活 [19]。据有关数据统计，报道出的染色体研究的鱼类大约2000多种，具有异型性染色体的鱼类大约50多种，仅占2.5%。如半滑舌鳎 [20]、灰海马 [21]、刀鲚 [22] 及短颌鲚 [23]；也有研究发现，同一物种不同性别间染色体数目存在差异性。如棘头梅童鱼核型2n = 48t (雌鱼)和2n = 46t + 1m (雄鱼) [24]；凤鲚雌性染色体数目为2n = 47，雄性染色体数目为2n = 48 [25]；条石鲷的雄性核型为2n = 3m + 44t，雌性核型为2n = 2m + 46t，且雄性具有1条中部着丝粒的巨型性染色体 [26]。在本研究中通过对雌雄虫纹鳕鲈染色体滴片发现，两者染色体目数及核型均无差别，且并未发现异型的性染色体。

一些研究认为鱼类染色体着丝粒臂间倒位只改变染色体臂数及形态，而染色体数目不变 [27] [28] [29]，这种现象在很多鱼类均有发现，如鲴亚科鱼类染色体数目一致，均为2n = 48，而臂数在92~94之间 [30] [31]；东方鲀属其染色体数目均为2n = 44，臂数则在62~66之间 [32]；拟鲼属鱼类染色体数目为2n = 52，其臂数为84~94之间 [33]；鲷科鱼类染色体数均为2n = 48，臂数在48~56之间 [34]。鲃亚科鱼类染色体数目为2n = 100，其的臂数范围是142~150 [35]。本研究也发现除了鳜属长体鳜(Coreosini percaroulei)以及麦氏鲈属九斑麦氏鲈(Macquaria novemaculeata)外，其它9种真鲈科鱼类二倍体染色体数目相同，均为2n = 48，染色体臂数在48~52之间。这些现象也进一步说明了鱼类核型的演化具有多态性，这可能跟生活环境及自然生态选择有关。另外，我们也发现，长体鳜及九斑麦氏鲈的染色体数目均出现不同程度的减少，可能是其在进化过程中染色体间发生了串联融合 [36]。而鲤科鱼类在核型系统进化过程中则不同，其染色体数目大幅度增加，如锦鲤、杞麓鲤、野鲤、镜鲤、红鲤等染色体数目均为2n = 100 [37] [38] [39] [40] [41]；染色体数目的增加可能使鱼类具备更多的遗传信息储存，加速其种群进化的多态性，从而保证其种群在自然恶劣环境中的生存。

李树森 [42] 认为，硬骨鱼类可以划分为2个类群：原始类群和特化类群；其中原始类群的鱼类具有相对较多的亚端部或端部染色体，而特化群体则相反。在石斑鱼23种类核型研究中，其中12种石斑鱼染色体臂数均为48，其染色体结构大体上群体演化过程中并没有发生大的变化，基本上保持了原始核型的

Table 3. Chromosome characteristics in percichthyidae

表3. 真鲈科鱼类染色体核型特征

形态，而其余11种染色体臂数均大于48，其染色体结构的变化较大，应属于特化类型 [43]；李安等对鮈亚科鱼类研究发现，䱻属鱼类位于系统发育树的底部，为较原始的类群，其次为鳈属，然后是鮈属，而似鮈属鱼类则处在系统发育树顶部，为特化类群 [44]。范瑞等对鳕鱼的研究也发现，宽突鳕属鱼类具有较多的中部着丝粒染色体，为特化类群，而鳕属则具有较多的端部和亚端部染色体，为原始类型 [45]。在本文对真鲈科鱼类研究中也发现真鲈科中的少鳞鳜属川目少鳞鳜与朝鲜少鳞鳜相比，臂数相对较多且大部分为中部或亚中部着丝粒染色体，应更加倾向于特化类群。而鳜属中的斑鳜、波纹鳜与鳜、大眼鳜及暗鳜相比，染色体臂数相对较少且大部分为端部或亚端部染色体，因此，它们更倾向于原始类群，在鳜属鱼类中是非常原始。综上可见，鱼类在进化方向上具有显著的差异性，即保留了原始的核型又展现了更加复杂、特化的核型，这可能与各自生活的地理环境及种群内在因素有关。

一些研究把真骨鱼类进化的类群分为3种：低位类群、中位类群及高位类群，其中端部及亚端部染色体数目多，臂数少的属于进化高位鱼类，反则属于低位类群 [46] [47]。如在对塘鳢科鱼类中的研究表明，脂塘鳢属鱼类核型中M型染色体较多，则属于典型的低位类群，而乌塘鳢属、塘鳢属、头孔塘鳢属、尖塘鳢属、鮈虾虎鱼属等属鱼类核型中A型染色体较多，则为高位类群 [48]；点篮子鱼的染色体数目为2n = 48，核型公式为2n = 4sm + 10st + 34t，为典型的高位类群染色体数目 [49]。鲃亚科鱼类的核型中中部或亚中部染色体较多，占总染色体数目的60%-76%，为典型的中低位鱼类 [50]。在本研究中所列数真鲈科鱼类均具有较多的亚端部和端部着丝粒染色体，中部或亚中部着丝粒染色体较少，染色体较为收敛，因此，应属于高位类群。由此可见，真鲈科鱼类大部分属于高位类群原始核型，这与同样是淡水的鲤科鱼类核型(中部或亚中部染色体较多，臂数较多) [51] 具有明显的差异。此外，由表3也可知，鳜属中的鳜和大眼鳜、本研究中的虫纹鳕鲈与长体鳜核型相近，根据亲本核型越相近，杂交成功率越高的原则，它们彼此之间具有杂交育种的可能性。

总体而言，鱼类在进化史中由于栖息环境、生活习性及地理条件等差异性，导致了鱼类演化的方向的多样性，核型展现出了保守性、趋同性及多态等现象，因此，仅仅简单的从核型上分析鱼类分类及演化问题是远远不够的，不能把其作为分类的唯一标准，而应结合全态学的研究方法，全面、准确的解决其演化问题，为系统发育分类提供重要的依据 [52]。对于本研究而言，我们通过虫纹鳕鲈的核型分析及与真鲈科已有核型鱼类综合比较，得出了一部分结果，为真鲈科鱼类地位的演化，系统的分类提供了一定的参考，但仍然需要进一步开展深入的研究，如C带、G带、银染、DNA含量、原位杂交等。

基金项目

科技人才和平台计划项目(院士专家工作站) (2018IC161)资助；青岛博士后应用研究项目(Q51201611)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项，(20603022015005)；江苏省国家长江珍稀鱼类工程技术研究中心培育点(BM2013012)共同资助。

NOTES

^*通讯作者。