1. 引言
多发性骨折是指由同一个致病因素引起的两处及以上的骨折的发生。多发性骨折的患者伤情复杂，抵抗力较为低下，容易引发术后感染，因此具有病情变化快、死亡率高的特点 [1]。对患者可能的术后感染情况进行及时准确的评估及干预治疗，是降低患者死亡率的有效途径。目前，主要通过临床症状表现对患者的术后感染情况进行鉴别诊断，而患者伤口的正常愈合往往能够掩盖其感染的临床症状，对临床感染的诊断起到一定的迷惑性，从而影响诊断的准确性。近年来，血清标记物在多种疾病中被大量挖掘，引起了国内外学者的广泛关注 [2]。多个术后感染的血清标志物也被报道，如血清原降钙素(procalcitonin, PCT)、c反应蛋白(C-reactive protein, CRP)等 [3] [4]。但是其在术后感染中的诊断特异性和敏感性存在争议 [5]。因此，更高敏感度和特异度的诊断标志物的筛选仍是当下研究的重点。
近年来，一种新型生物标志物，循环microRNAs (miRNAs)，在各种疾病中被广泛报道。miRNAs是一类小型的非编码RNA，在细胞的多个过程中发挥着重要的作用。miRNAs在血清或血浆中稳定表达，低浓度的RNA就足以用于血清miRANs差异表达谱的筛选构建 [6]。miRNAs在不同疾病中的表达模式和功能，有助于血清miRNAs临床价值的评估和应用 [7]。microRNA-223 (miR-223)是一种造血特异性microRNA，在髓系发育中具有重要功能 [8]。据报道，miR-223在多种疾病中异常表达，通过靶向不同的靶基因来调节机体炎症反应，进而参与疾病的进展，如败血症、类风湿性关节炎、病毒感染(如人类免疫缺陷病毒1 (HIV-1))等 [9]。miR-223在脓毒症患者中异常表达，被认为是一种新的脓毒症的血清生物标志物 [10]。在一项非小细胞肺癌的研究中，miR-223被检测到在术后患者的血清中显著降低，推测其可能参与了术后的疾病恢复进程 [11]。因此，miR-223在多发性骨折患者术后感染中的临床价值引起了我们的兴趣。
因此，本研究共纳入120例多发性骨折患者，并通过qRT-PCR检测miR-223在患者血清中的表达水平。旨在探讨多发性骨折术后感染患者中血清miR-223的表达水平变化，并对其诊断价值进行评估，拟为多发性骨折二次术后感染的诊断以及治疗提供一定的理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 研究对象
选取于我院收治的120例多发性骨折患者，根据术后感染情况，分为感染组和非感染组。患者的术后感染状况通过临床查体、影像学检查、实验室检查及病原菌培养进行确诊，均符合《医院感染诊断标准(试行)》要求 [12]。患者排除标准：1) 年龄小于18周岁；2) 病理性骨折及非外伤引起的骨折；3) 严重肝、肾疾病；4) 恶性肿瘤；5) 自身免疫疾病、血液疾病、肺结核、有机磷中毒及肝脏暴力损伤的患者。感染组中共有男性50例，女性15例，平均年龄47.62 ± 10.20；在致伤原因方面，39例为交通事故，14例为高空坠落，12例为重物压伤。非感染组中共有男性41例，女性14例，平均年龄46.75 ± 9.36；在致伤原因方面，29例为交通事故，16例为高空坠落，10例为重物压伤。
本研究所有患者均签署了知情同意书，并经过青岛大学医学部临床医学院医学伦理委员会的审查批准。
2.2. 样本采集
所有患者入院时对患者的临床信息进行收集，并记录病史。患者于术前一天清晨，收集静脉血3 ml，血液样本在无菌乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)试管中分离，随后离心15分钟，收集血型，于−80℃冰箱保存备用。
2.3. RNA提取及实时荧光定量PCR
根据说明书的要求，使用TRIzol (Invitrogen, USA)进行总RNA提取。使用逆转录试剂盒进行反转录，得到cDNA。扩增反应在ABI 7300 qRT-PCR仪上进行，使用SYBR green I Master Mix试剂盒(Invitrogen, USA)进行反应。反应条件为：95℃ 15 min；94℃ 15 s；55℃ 30 s；70℃ 34 s，共40个循环。以U6作为miRNA表达量的内参，且其相对表达量用2−ΔΔCt的方法进行计算。引物序列如下：miR-223 forward：5’-GCAGCCTGTCAGTTTGTCA-3’，reverse：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；U6 forward：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，reverse：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。
2.4. 统计学分析
本实验所有数据和分析均采用SPSS 21.0软件进行。组间计量资料通过独立样本t测验进行组间比较，计数资料进行卡方检验。通过绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)，对其诊断价值进行评估，选取约登指数最大时为最佳筛选界值。所有数据当P < 0.05时认为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 人口及临床资料
表1结果显示，感染组和非感染组患者在年龄、性别、损伤严重程度、致伤原因、合并糖尿病等临床资料方面，差异不显著。
Table 1. Demographic and clinical characteristics between groups
表1. 组间的人口统计学和临床特征
3.2. 患者血清CRP及miR-223水平
通过独立样本t测验，对两组患者的血清CRP和miR-223水平进行了比较分析，结果显示，术前感染组的患者血清CRP水平显著高于非感染组，而血清miR-223水平则显著低于非感染组(表2)。
Table 2. Comparison of serum CRP and miR-223 levels of patients before the reoperation
表2. 术前患者血清CRP及miR-223水平比较
3.3. 血清CRP及miR-223的临床预测价值分析
根据患者血清CPR和miR-223的表达水平，分别绘制ROC曲线，对其诊断价值进行评估。结果显示，血清CRP预测多发性骨折患者术后感染的曲线下面积(AUC)为0.812，灵敏度和特异度分别为76.9%和72.7%。血清miR-223的AUC为0.822，灵敏度和特异度分别为84.6%和74.5%。
此外，我们进一步使用分析了血清CRP和miR-223的联合诊断能力，结果显示，血清CRP和miR-150联合诊断患者术后感染的AUC为0.928，敏感度和特异度分别为96.4%和76.9%，均高于单个指标的预测结果(表3)。
Table 3. Combined diagnostic value of serum CRP and miR-223 levels in prediction of the infections in the multiple fracture
表3. 血清CRP及miR-223水平联合诊断预测多发性骨折二次手术术后感染
4. 讨论
随着生活节奏的加快及交通工具的普及，创伤成为威胁人类安全的原因之一，由创伤带来的多发性骨折患者也逐渐增加 [13]。多发性骨折患者术后常并发全身炎症反应综合征，是死亡率高的重要因素。临床上，对患者的术后感染情况进行准确评估，把握好手术时机，是改善多发性骨折患者预后的重中之重。近年来，血清标志物的筛选在多种疾病中被广泛关注和应用。与术后感染相关的血清标志物也引起了学者的兴趣，其中CRP和PCT是报道较多的两个血清标志物 [14]。CRP是一种急性反应蛋白，是感染和炎性疾病的敏感标志物。感染和炎症发生后几小时CRP浓度会迅速上升，感染控制或炎症消除后，很快恢复正常。在临床上常通过检血清CRP浓度，判断患者的炎症程度，并对病毒或细菌感染进行初步判断。尽管CRP广泛应用于临床上的炎症反应评估，但是其诊断特异性不高。本研究对血清CRP在多发性骨折患者术后感染的预测价值进行了评估，结果发现，术后感染组的患者术前血清CRP显著高于非感染组，且ROC曲线结果证明，血清CRP对多发性骨折患者二次术后感染具有一定的诊断价值，这与前人的研究结果一致 [15]。
miRNAs是一种或多或少由22个核苷酸组成的小的非编码RNA序列，通过与其3’未翻译区域互补配对，抑制特定mRNA靶点的翻译，从而在转录后水平上调控基因表达。MiR-223是高度保守的miRNA，之前的研究已经报道了大量miR-223的靶点，包括胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、单核细胞增强因子2C、stathmin 1、青蒿素和FOXO1A等 [16]。近年来，miR-223在免疫和抗炎反应中的潜在作用被多番报道，被评定为有效的负性炎症调节因子。据报道，miR-223下调能够促进多种促炎因子的释放，如IL-6、IL-1β等 [17]。miR-223在人类先天免疫中的作用也引起学者越来越多的关注 [18]。研究表明，miR-223的异常表达与多种人类疾病的生理病理相关 [19]。在脓毒症患者中，miR-223被报道在脓毒症患者的血清中低表达，与患者的感染状况密切相关 [20]。本研究通过qRT-PCR对多发性骨折患者术前的血清miR-223水平进行了检测，结果发现，miR-223在术后感染组患者的血清中的表达水平显著低于非感染组，与以往的研究结果一致 [10] [11]。此外，我们进一步绘制ROC曲线，对其诊断水平进行评估。结果表明，血清miR-223对多发性骨折患者术后是否发生感染有一定的预测价值，且其敏感度和特异度均高于血清CRP。
临床上，有时候单单用某一指标进行诊断，常存在灵敏度或特异度不足的问题，这时候，我们可以考虑联合试验 [21]。所谓联合试验，即将两个及两个以上指标联合用于疾病诊断。本研究进一步评估了血清miR-223和CRP的联合诊断水平。结果表明，血清miR-223和CRP联合诊断的敏感度和特异度均高于单一指标的诊断结果。但是，本研究的样本量较小，对于miR-223在多发性骨折术后感染中的作用，需要在更大的样本中进行进一步的验证。
总之，本研究结合临床资料证实血清miR-223在多发性骨折术后感染的患者中低表达，可能是预测多发性骨折术后感染的一个潜在的生物标志物。血清miR-223和CRP联合诊断能够提高诊断的准确性。
NOTES
*通讯作者。