1. 引言
虾酱是海南及我国沿海地区传统的发酵调味品，蛋白水解是影响虾酱感官和风味最重要的因素之一。发酵过程中，酸、碱和蛋白酶共同推动蛋白水解进程。早期，肌肉组织的内源蛋白酶释放出来参与组织蛋白的水解。随着发酵进行，微生物代谢产生的胞外蛋白酶和肽酶将肌肉蛋白进一步水解。水解形成的小分子化合物促进酶促反应和非酶化学反应，形成非蛋白的含氮化合物，进而形成食物的特殊营养、香味、pH值和口感 [1]。海南地处热带，常年气温较高，海南虾酱中盐度较高，虾酱中微生物有较好的温度和盐度适应能力 [2]。因此，从海南虾酱中分离产蛋白酶的微生物，可能获得发酵特性较好的菌株。本研究以海南传统虾酱为实验材料。首先，应用Gibbons培养基对富集后的细菌分离和纯化。然后对菌株的蛋白水解能力进行定性和定量分析。最后结合菌株的菌落和细胞形态、生理生化特征和16S rDNA序列信息确定菌株的分类学地位。研究结果可为解析虾酱风味形成的分子机制和虾酱的工业化生产提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 材料和试剂
2.1.1. 实验原料
羊栏镇、天涯区、崖州区、乐东县、东方市、万宁市、琼海市、秀英区、澄迈县、海口市等海南沿海地区的15份传统虾酱样品。
2.1.2. 培养基
Gibbons培养基 [3]：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉10.0 g，柠檬酸钠3.0 g，氯化钾2.0 g，硫酸镁∙7H2O 20.0 g，氯化钠50.0 g，添加1000 mL蒸馏水，琼脂15 g。调pH 7.2，121℃灭菌20 min。
酪蛋白琼脂平板 [4]：分别称取10 g脱脂奶粉和3 g琼脂，分别溶于100 mL蒸馏水，然后分开灭菌两种溶液。待溶液冷却至48℃左右，将两种溶液混合均匀倒平板。
2.1.3. 主要试剂
酪蛋白/胰蛋白胨、酵母粉、无水硫酸镁、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾、琼脂/琼脂糖、脱脂乳粉、Tris碱、EDTA-Na∙2H2O、溶菌酶、溴酚蓝、二甲苯青、甘油、硼酸、海藻糖、抗坏血酸钠、Taq酶(ET101-02-04，天根生化科技(北京)有限公司)等。
2.1.4. 主要设备
超净工作台(SW-CJ-1FD)：苏州安泰空气技术有限公司；恒温培养箱(SPX-150B-Z型：博讯实业有限公司医疗设备厂；紫外可见分光光度计(T6新世纪)：北京普析通用仪器有限责任公司；高速冷冻离心机(Sigma-16)：Sigma；恒温震荡培养箱(HO45HYA)：上海知楚仪器有限公司；高通量组织研磨器(SCIENTZ-48)：宁波新芝生物科技股份有限公司；电泳仪(DYY-10C型)：北京六一；精密分析天平(AR2140)：梅特勒–托利多仪器有限公司；PCR仪(T100TM)：Bio-Rad；凝胶成像系统(GDS-1302)：Aplegen等。
2.2. 实验方法
2.2.1. 具有蛋白质水解能力菌株的筛选
1) 细菌的富集及初步筛选
将20.0 g虾酱样品加入装有180 ml无菌生理盐水的锥形瓶中，振荡30 min。静置，取上清液100 ul接种于5.0 ml Gibbons液体培养基中进行富集 [3]。取0.5 ml富集培养液按10倍梯度稀释，选合适梯度浓度接种于Gibbons固体培养基，30℃培养24~48 h。取单菌落进行分离纯化，纯化的菌株用15%甘油保存备用 [5]。
2) 初筛具有蛋白水解能力菌株
将活化的菌株点接到酪蛋白琼脂平板上，适宜温度下培养24 h。以不接菌的平板为空白组，观察菌落周围是否形成透明圈 [6]。
3) 定量分析菌株对蛋白质的水解能力
参考文献制作酪氨酸标准曲线 [7]。配制梯度浓度的酪氨酸溶液，反应后用紫外分光光度计在680 nm处测定光密度。平行测定3次，以酪氨酸的含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。
Folin-酚法定量分析菌株蛋白水解能力 [8]。吸取菌液1.00 mL与酪蛋白溶液反应，用福林试剂进行显色，测定显色反应后的光密度。用酪氨酸标准曲线和光密度计算酪蛋白水解后生成酪氨酸的量。在40℃和合适pH值条件下，1 min内水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位 [9]。
2.2.2. 菌株的初步鉴定
1) 形态学观察
记录菌落形态一致的菌株，并在光学显微镜下观察菌株被革兰氏染色的细胞形态 [10]。
2) 菌株生理生化特征分析
(1) 最适温度
将菌株活化后接种到Gibbons液体培养基中，用不接菌的Gibbons液体培养基做空白组，将培养基分别放入28℃、30℃、31℃、32℃、33℃、36℃和37℃等温度下培养24 h。每个温度三组平行实验，用紫外分光光度计测定OD600 nm下的吸光值，考察菌株对温度的适应能力 [11]。
(2) 最适盐浓度
取菌液100 uL加入10 mL液体Gibbons培养基中，培养24 h后制成菌悬液。用低吸附枪头分别取2 ul菌液，接到0%、2%、5%、10%、15%和20%等不同盐浓度的培养基中，每个盐浓度做三组平行实验。在适宜温度下培养24h后，用紫外分光光度计测OD600 nm下的吸光值，考察菌株的耐盐能力 [12]。
(3) 最适pH值
取菌液100 uL加入10 mL液体Gibbons培养基中，培养24 h后制成菌悬液。用低吸附枪头分别取2 ul菌液，接到不同pH值的Gibbons液体培养基中，每个pH值做三组平行实验。在适宜温度下培养24 h后，用紫外分光光度计测OD600 nm下的吸光值，考察菌株的耐酸能力 [13]。
(4) 菌株生长的生长曲线
根据菌株的酸碱适应能力，配制合适的Gibbons液体培养基。用低吸附枪头分别取2 ul菌液，接到Gibbons液体培养基中，合适温度下分别培养2、4、6、8、10、12、16和24 小时。以不接菌的培养基做空白组，用紫外分光光度计测不同培养时间菌液OD600 nm下的吸光值，考察菌株的生长特性 [14]。
3) 分子鉴定
(1) DNA提取
菌株DNA提取参考文献进行，−20℃保存DNA样品 [15]。
(2) PCR扩增
采用细菌扩增通用引物27F和1492R进行PCR扩增 [16]。PCR扩增反应体系参考试剂盒(ET101-02-04，天根生化科技有限公司)：引物1 uL，DNA模板1.0 uL，Taq PCR Master mix 0.2 uL，ddH2O 14.8 uL。PCR 扩增反应程序：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，30次循环，72℃ 10 min，4℃保温 [17]。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送公司测序(上海生工)。
(3) 测序和系统发育树构建
将测得序列在NCBI中进行同源性比较，然后用Mega7.0.14软件构建系统发育进化树 [18]。根据系统发育树，结合菌株的形态和生理生化特征初步确定菌株的分类学地位。
3. 结果与分析
3.1. 筛选蛋白水解能力的菌株
按照2.2.1.1的方法，将15份虾酱进行涂布培养，共获得124个菌株纯化菌株。其中6#菌株的菌落形态呈淡米黄色，不透明，边缘光滑，湿润且扁平(图1(A))。按照1.2.1.2的方法,用酪蛋白琼脂平板定性检测菌株的蛋白水解能力，菌株培养24小时后，菌株能显著水解蛋白，在平板上形成透明圈(图1(B))。按照2.2.2.1的方法，对6#菌株进行革兰氏染色观察，菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌(图1(C))。
备注：(A) 6#菌株菌落形态；(B) 定性分析6#菌株的蛋白水解能力；(C) 6#菌株的革兰氏染色。
Figure 1. Screening and analysis of Protease Producing Strains
图1. 产蛋白酶菌株的初步筛选和分析
3.2. 菌株的生理生化特性分析
3.2.1. 定量分析6#菌株的蛋白水解能力
根据2.2.1.3所述的方法制作标准曲线(图2(a))。以酪氨酸浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，标准曲线回归方程为y = 0.0125x + 0.0098，相关系数R2 = 0.9990，吸光值与酪氨酸浓度之间的线性关系显著。根据标准曲线及回归方程，可算出当吸光值为1时酪氨酸的含量96.2 ug/mL,吸光常数值K = 96.2。
利用标准曲线，采用Folin试剂法定量测得6#菌株的粗酶液活力为111 ± 0.03U (图2(b))。结合图1(B)和图2(b)可知，6#菌株可产生胞外蛋白酶，将蛋白水解成酪氨酸等氨基酸，供给菌株新陈代谢所需要的营养。已有研究表明，菌株蛋白水解能力与菌株的酶系相关，包括胞外酶、转运系统和多种胞内酶 [19]。同时，菌株的蛋白质水解会生成的氨基酸及多肽等小分子物质可能影响虾酱的风味。
注：(a) 酪氨酸标准曲线；(b) 6#菌株发酵液酶活；(c) 菌株温度适应性；(d) 菌株的耐盐能力；(e) 菌株的耐酸能力；(f) 菌株的生长曲线；OD680和OD600分别表示紫外分光光度计在680 nm和600 nm的吸光值。
Figure 2. Physiological and biochemical characteristics of strains
图2. 菌株的生理生化特性
3.2.2. 菌株的基本生理生化特性
按2.2.2.2所述方法，测得菌株生长的温度适应能力(图2(c))。由图可知，菌株的最适温度在33℃左右，菌株有较好的温度适应能力，能适应海南当地的较高的环境环境温度。温度高过33℃后，菌株生长受到一定的抑制，但仍表现出较高的紫外吸收光。在虾酱发酵的过程，可利用菌株对温度适应的特性，优化发酵温度，缩短发酵时间。
按2.2.2.2所述方法，测得菌株生长的最适盐浓度(图2(d))。由图可知，菌株生长的最适盐浓度在5%~10%之间。在15%的盐浓度下，菌株仍有较好的生长能力。在20%的盐浓度条件下，菌株受到明显的抑制，但培养24小时后，仍可测出一定的微生物。总体看来，菌株有较好的盐度适应能力。
按2.2.2.2所述的方法，测得菌株在不同pH条件下的生长情况(图2(e))。由图可知，菌株在pH为2到4之间的生长缓慢，在pH为4到7.5之间的生长速度加快。pH值为6~8是菌株最合适的生长酸碱度，在pH值为7.5~10时，菌株的生长能力受到抑制。
按2.2.2.2所述方法，测得菌株的生长曲线(图2(f))。由图可知，菌株的生长迟缓期约在2~6 h，10 h左右为对数生长期，约15 h左右后进入生长稳定期。稳定期曲线呈略为上扬，可能后期代谢废物影响了吸光度的测量，但两点间在统计学上没有显著差异。
3.3. 菌株的分子鉴定
按照2.2.2.3所述方法，以6#菌株的DNA为做模板，以27F和1492R为引物进行PCR扩增和电泳检测(图3(a))，PCR产物送上海生工测序。将测序结果与NCBI数据库中已知序列进行同源性比对，获得近缘物种的16S rDNA序列，并用Mega7.0.14构建6#菌株的系统发育树(图3(b))。6#菌株与弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus H4的相似度为99.85%，结合菌株的形态和生理生化特性，6#暂命名为Bacillus sp. 6#。参考98.5%的分类标准 [20]，99.85% > 98.5%，6#菌株可能为弯曲芽孢杆菌。
(a) (b)注：(a) PCR扩增和电泳检测6#菌株的16S rDNA；(b) 6#菌株的系统发育树
Figure 3. Analysis of 16S rDNA of strain 6 by sequencing
图3. 测序分析6#菌株的16S rDNA
4. 讨论和结论
本研究从海南地区的传统虾酱中筛选获得了一株产蛋白酶菌株，经过形态学观察、生理生化分析和分子生物学鉴定其为芽孢杆菌，菌株可能为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，暂命名为Bacillus sp. 6#。本研究发现，该菌株的最适生长温度在33℃左右，最适合盐浓度在10%左右，能耐受接近20%的盐度，菌株有较好的温度和盐度适应能力。菌株能产胞外酶白酶，加速蛋白水解，影响虾酱的感官和品质。已有研究表明，弯曲芽孢杆菌具有分解胆固醇 [21]、抗氧化 [22] 和抗菌 [23] 等益生特性。因此，Bacillus sp. 6#可为工业化纯种生产模式下虾酱生产提供一种可行的参考。
基金项目
海南热带海洋学院青年专项基金(RHDQN201832)、2018年三亚市专项科研试制项目(2018KS01)和2016年校级学科带头人及博士科研启动项目(RHDXB201623)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。