摘要:
目的：采用高效液相色谱法测定甲硝唑片制剂中的有关物质并进行杂质谱研究。方法：以Welch Ultimate® XB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)色谱柱为分析柱；结果：甲硝唑与有关物质具有良好的分离度，分离度均大于2，并对3批自制甲硝唑片有关物质进行考察，与原研市售品相当，均满足质量控制标准。结论：本方法简便、快速、灵敏、准确，可作为甲硝唑片有关物质的检测方法，同时杂质谱研究有助于保证甲硝唑片质量标准性。
Abstract:
Objective: To determine the related substances in metronidazole tablets preparation by high per-formance liquid chromatography and to study the impurity profile. Method: Welch Ultimate® XB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) chromatographic column was used as the analytical column; the results showed that metronidazole and related substances had a good resolution, and the resolution was greater than 2. The related substances of azole tablets were investigated, and they were equivalent to the original commercial products, and all met the quality control standards. Conclusion: This method is simple, rapid, sensitive and accurate. It can be used as a detection method for related substances in metronidazole tablets. At the same time, the study of impurity profile can help ensure the quality standard of metronidazole tablets.
1. 引言
甲硝唑片是目前用于治疗或预防厌氧菌引起的系统或局部感染的首选药，临床常用于腹腔、消化道、女性生殖系、下呼吸道、皮肤及软组织、骨和关节等部位的厌氧菌感染，效果显著 [1] - [6]。其中原料药甲硝唑为2-甲基-5-硝基咪唑与环氧乙烷羟乙基化所得的产物。
2. 仪器与试药
2.1. 仪器
LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，包括紫外检测器，在线脱气机，四元梯度泵，化学工作站；Ultimate XB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)型色谱柱(上海月旭科技股份有限公司)。AB135-S型十万分之一电子分析天平(德国梅特勒-托利多公司)；R200D型万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)；Labonce500TPS型强光稳定性试验箱(北京兰贝石恒温技术有限公司)；SHH-150SD型恒温恒湿箱(重庆永生实验仪器厂)；PHG-9030A型烘箱(上海精宏实验设备有限公司)；TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器有限公司)；KQ600型超声波(昆山市超声仪器有限公司)。
2.2. 药品与试剂
甲硝唑工作对照品(武汉武药制药有限公司，批号：DZC04-190187，含量：99.69%)。空白辅料(北京春风药业有限公司自制，批号：190903)。杂质A对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100512-201804，含量：100%)，杂质B对照品(LGC Labor GTmbH，批号：G173013，含量：99.92%)，杂质C对照品(QUALITY CONTROL CHEMICALS INC.，批号：21-APR-17-03，含量：88.18%)，杂质D对照品(Toronto Research Chemicals，批号：21-APR-17-03，含量：99.26%)，杂质E对照品(Toronto Research Chemicals，批号：5-CHG-94-3，含量：99.40%)，杂质F对照品(QUALITY CONTROL CHEMICALS INC.，批号：06-APR-17-06，含量：99.07%)，杂质G对照品(Toronto Research Chemicals，批号：2-PYL-32-1，含量：98.40%)；其化学结构分别为2-甲基-5-硝基咪唑、4-硝基咪唑、2-(4-硝基-1H-咪唑-1-基)乙醇、2-(5-硝基-1H-咪唑-1-基)乙醇、2-(2-甲基-4-硝基-1H-咪唑-1-基)乙醇、2-[2-(2-甲基-5-硝基-1H-咪唑-1-基)乙氧基]乙醇、2-(2-甲基-5-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酸。甲硝唑片工艺验证批样品(北京春风药业有限公司，批号：201912007，202001004，202001005)。甲硝唑片参比制剂(Sanofi，批号：124080B，135790C，142860D)。甲醇为色谱级，购自MREDA；磷酸二氢钾为分析纯，购自国药集团；氢氧化钠为分析纯，购自北京化工厂；盐酸为分析纯，购自北京化工厂；过氧化氢为分析纯，购自天津大茂；纯净水(屈臣氏，批准号：GB 19298)。微孔滤头，型号PTFE (0.45 μm, 25 mm)与尼龙(0.45 μm, 25mm)，均购自上海安谱 [7] [8]。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
Welch Ultimate® XB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)色谱柱为分析柱；甲醇-1.36 g/L磷酸二氢钾缓冲液(20:80)为流动相；流速为1 mL/min；柱温为40℃；检测波长为315 nm；进样体积为10 μL。
3.2. 溶液的配制
空白溶剂：甲醇–水(20:80)。
空白辅料溶液：精密称取空白辅料约100 mg，置200 ml量瓶中，加甲醇适量，超声20分钟(40 kHz，500 W，每5分钟振摇30秒)，放冷后，用溶剂稀释至刻度，摇匀，离心10 min (室温，转速：5000转/min)，取上清液作为空白辅料溶液。
杂质定位溶液：取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G适量，用溶剂各稀释成10 μg/ml的定位溶液，作为杂质定位溶液，结果见图1。
3.3. 样品中有关物质的测定
对本品三批样品及三批原研市售品有关物质进行测定，同时取各杂质混合溶液进行定位，确定样品中各杂质情况。结果显示，验证三批甲硝唑片样品有关物质中均检测出已知杂质A，原研市售品检出已知杂质A，且样品杂质检出含量均很小；样品的有关物质水平与市售品的相当：任何单一杂质(包括已知杂质)的量均小于本品的鉴定阈值0.10%，杂质总量也远低于0.5%；而且3批工艺验证样品的杂质含量水平相当。表明了样品质量安全，工艺稳定，同时也说明了此方法有助于保证甲硝唑片生产过程中有关物质的考察研究。具体见表1。
Table 1. Test results of related substances in metronidazole tablets samples
表1. 甲硝唑片样品中有关物质检测结果
4. 结论
本研究建立的高效液相色谱(HPLC)法，将甲硝唑片及制剂生产过程中可能产生的7种有关物质进行了有效分离，方法简便、灵敏，对甲硝唑片单个杂质和总杂质进行了有效地控制。并通过甲硝唑片强降解实验进行分析，了解杂质的产生原因，杂质的变化情况，为制剂中杂质的定性、定量研究提供实验准备。
本实验通过对比自制品和原研市售品甲硝唑片中杂质的种类和数量，了解到自制品与原研品在杂质控制水平上相当，可推测到自制品质量安全，工艺稳定，对甲硝唑片的质量考察研究具有重要意义。
基金项目
北京市怀柔区科技计划资助项目。
NOTES
*通讯作者。