1. 引言
水杨酸(salicylic acid, SA)是植物体内一种小分子酚类有机物质，作为内源激素参与调控植物内许多重要生理活动。SA参与水稻、番茄、大豆等多种植物的抗病防御的生物胁迫过程，在植物的系统获得性免疫过程中起着关键调控作用 [1] [2]。外源添加SA可以增加植物的抗病能力，SA在植物内的合成、感知及信号传导也得到了广泛研究，例如NPR1/3/4、TGA2/5/6等蛋白均参与SA的信号传导过程 [2]。SA参与植物的多种非生物胁迫响应过程，例如植物在热胁迫时，细胞内钙离子浓度增加，促进了SA的合成，SA进一步调控NRP1等基因的表达，正调控植物的热胁迫响应过程 [3] [4]；SA还参与植物对镉胁迫响应过程 [5] [6]，以及参与植物的避光反应过程 [7]。此外，SA还参与种子萌发、营养生长，以及生殖生长等植物生长发育过程 [8] [9]。
生长素是植物体内非常重要的一种吲哚类激素，参与植物整个生长发育过程的调控，例如种子萌发、营养生长，及生殖生长。生长素合成、运输，以及信号传导均参与生长素对植物生理活动的调控过程，这些在植物对植物的调控过程被广泛研究，例如，YUC家族蛋白参与生长素的合成过程，水稻中OsYUC3、OsYUC5、OsYUC6等基因的过表达导致根生长形态异常 [10] [11]；PIN家族蛋白参与生长素的极性运输过程，水稻中OsPIN2通过调节生长素的分布参与水稻根的伸长生长及侧根的发育过程 [12] [13]。
在拟南芥中的研究发现，外源施加低浓度的SA (<50 µM)和高浓度的SA (>50 µM)调控了生长素和合成和运输过程，以两种不同的pathogenesis-related 1 (PR1)方式调控了拟南芥根的分生组织的生长发育 [8]。本研究旨在采用DR5启动子驱动GUS报告基因的转基因水稻为研究材料，通过监测水稻幼苗生长的变化，及其中生长素的积累和分布变化，探究不同浓度的水杨酸对水稻幼苗生长的影响及其调控机制。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料与处理设计
选取籽粒饱满的DR5-GUS转基因水稻种子，采用消毒液(75%的乙醇、2%次氯酸钠)消毒20 min，然后无菌水冲洗干净后，置于无菌水中避光浸种48小时。浸种后的种子置于培养箱中(光周期：14 h光/8 h暗；光照强度：200 µmol·(m2·s)−1，温度：26℃)催芽，至胚根长约0.5 cm时，转入水稻培养盒中(黑色，96孔，孔径6.3 mm)，适应24 h后，分别采用Hoagland培养液，以及Hoagland培养液加不同浓度的SA (10 µM, 1 mM)进行处理。
2.2. 生长指标统计
株高、初生根长度、不定根长度采用直尺进行测量。初生根上侧根数目和长度在解剖镜下进行统计完成。每个处理的统计至少60株幼苗。
2.3. GUS染色
依据文献所述方法进行GUS染色，测定根系生长素的分布和积累 [14]。每个处理至少测定20株水稻幼苗的GUS活性。
2.4. RT-PCR
采用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，采用反转录试剂盒(Promega)得到cDNA，以OsActin基因为内参基因，分析目的基因表达水平的变化。采用Gel-Pro Analyzer软件对基因的转录水平进行半定量分析，对照设置为1，相对于对照数值≥1.3为表达上调，相对于对照数值≤0.7为表达下调 [15]。
2.5. 数据处理
采用SPSS软件对实验数据进行分析，实验结果采用至少三次独立重复的平均值和标准误差表示。采用t检测分析水稻幼苗SA处理组与对照组之间的差异，p < 0.05代表差异显著。
3. 实验结果
3.1. 不同浓度水杨酸处理对水稻幼苗生长的影响
水杨酸调控植物内许多重要的生理活动，为了探究不同浓度水杨酸对水稻幼苗生长的影响，我们通过观察不同浓度SA对水稻幼苗株高和初生根根长的影响发现，相对于对照不处理，低浓度的SA (10 µM)处理2天对水稻幼苗生长无明显影响，处理4天显著促进水稻幼苗的初生根根长，处理8天同时促进了水稻幼苗的株高和初生根根长(图1，图2)；而高浓度的SA (1 mM)处理2天、4天和8天均明显抑制水稻幼苗的株高和初生根根长(图1，图2)。以上结果表明，低浓度10 µM SA处理水稻幼苗，促进了水稻幼苗的生长，高浓度1 mM SA处理水稻幼苗，抑制了水稻幼苗的生长。
Figure 1. The changes in rice morphology on different days of different concentrations of SA treatment
图1. 不同浓度SA处理不同天数水稻形态的变化
Figure 2. The changes in rice plant height and primary root length on different days of different concentrations of SA treatment
图2. 不同浓度SA处理不同天数水稻株高和初生根长度的变化
为了进一步探究低浓度SA和高浓度SA处理对水稻幼苗生长的影响，我们进一步观察了SA处理对水稻幼苗初生根上侧根数目和侧根长度，以及不定根数目和不定根长度的影响。低浓度SA处理的实验结果显示，相对于对照不处理，低浓度的SA处理4天和8天均促进了初生根上侧根数目(图3)；处理4天对初生根上侧根的长度无明显影响，处理8天抑制了初生根上侧根长度(图3)；处理4天和8天对不定根数目无明显影响(图3)；处理4天促进了不定根的长度，处理8天时，与对照相比，无明显差别(图3)。高浓度SA处理的实验结果显示，相对于对照不处理，高浓度的SA处理4天和8天均抑制了水稻幼苗初生根上侧根数目和侧根长度，以及不定根长度(图3)；处理4天对不定根数目无明显影响，处理8天促进了不定根数目(图3)。以上结果表明，低浓度10 µM SA和高浓度1 mM SA调控了水稻幼苗初生根上侧根数目和长度，以及不定根的数目和长度，并且调控作用随处理的时间不同而不同。
Figure 3. The changes in rice lateral root number and length, adventitious root number and length on different days of different concentrations of SA treatment
图3. 不同浓度SA处理不同天数水稻初生根侧根数目、初生根侧根长度、不定根数目、不定根长度的变化
3.2. 不同浓度水杨酸处理对水稻幼苗中生长素积累分布的影响
生长素在植物内的含量和分布直接调节了植物的生长过程，为了探究低浓度10 µM SA和高浓度1 mM SA如何调控了水稻幼苗的生长，我们采用GUS染色观察了水稻幼苗根部生长素的积累分布变化。实验结果显示，低浓度10 µM SA处理2天后，初生根的生长素积累明显低于不处理对照组(图4)；处理4天后，初生根的生长素积累相对于对照组的降低趋势有缓解(图4)；处理8天后，初生根的生长素积累与对照组相比无明显差别(图4)。高浓度1 mM SA处理2天后，初生根的生长素积累与对照组相比无明显差别(图4)；处理4天后，初生根的生长素与对照组相比呈现过度积累现象(图4)；处理8天后，初生根的生长素与对照组相比过度积累现象更加明显(图4)。
Figure 4. The changes in auxin accumulation and distribution in rice on different days of different concentrations of SA treatment
图4. 不同浓度SA处理不同天数水稻中生长素积累分布的变化
进一步观察了不同浓度SA处理后，水稻初生根根尖的生长素积累分布的影响。实验结果显示，低浓度10 µM SA处理2天和4天，水稻根尖生长素积累都明显低于不处理对照组，但是处理4天降低趋势有缓解(图5)；处理8天后，初生根的生长素积累与对照组相比无明显差别(图5)。高浓度1 mM SA处理2天后，初生根的生长素积累与对照组相比无明显差别(图5)；处理4天后，初生根根尖成熟区的生长素与对照组相比呈现过度积累现象(图5)；处理8天后，初生根根尖成熟区的生长素与对照组相比呈现过度积累现象，但是分生区和伸长区生长素积累明显降低(图5)。
Figure 5. The changes in auxin accumulation and distribution in the root tip of rice primary roots on different days of different concentrations of SA treatment
图5. 不同浓度SA处理不同天数水稻初生根根尖生长素积累分布的变化
以上结果表明，低浓度10 µM SA和高浓度1 mM SA对水稻幼苗的生长调控作用，可能通过调控生长素的含量分布实现的。
3.3. 不同浓度水杨酸处理对水稻幼苗中生长素合成和运输基因的影响
生长素在植物内的合成和运输过程参与调控生长素在植物内的含量和分布，为了进一步探究生长素的合成和运输是否参与SA对水稻幼苗的生长调控过程，我们采用半定量的RT-PCR实验发现(引物见表1)，相对于对照不处理组，低浓度10 µM SA促进了OsYUC4、OsYUC6、OsYUC7、OsPIN9的基因表达，抑制了OsYUC1、OsYUC5的基因表达；而高浓度1 mM SA促进了OsYUC4、OsYUC6、OsYUC7的基因表达，抑制了OsYUC1、OsYUC3、OsYUC5的基因表达(图6)。这些结果表明，生长素合成与运输基因通过介导了生长素的含量和分布，参与低浓度SA和高浓度SA对水稻幼苗的生长调控作用。
Figure 6. The changes in the expression of auxin synthesis and transport genes in rice primary roots after the treatment of different concentrations of SA for 8 days
图6. 不同浓度SA处理8天时水稻初生根中生长素合成运输基因表达的变化
Table 1. Primers used in this study
表1. 本研究所用的引物
变性温度：94℃；退火温度：56℃；延伸温度：72℃。
4. 讨论
SA参与植物生理活动的调控具有普遍性，例如，在水稻中，外源施加SA调节了水稻的根系发育 [16]；在草莓中，外源施加SA可能通过调控了SnRK1的活性调节了草莓的生长 [17]；在玉米中，外源施加SA可以提高玉米种子萌发早期的抗旱性 [18]；在直根系植物拟南芥中，外源施加低浓度SA (<50 µM)促进了不定根的生长，而高浓度SA (>50 µM)抑制了拟南芥不定根的生长，进而影响了拟南芥的根形态。在本实验中，外源施加SA调控了水稻幼苗的生长状态，并且呈现低浓度(10 µM)促进高浓度(1 mM)抑制的趋势。本实验中，外源施加SA对水稻的调控浓度与之前报道中对拟南芥的调控浓度类似，说明外源施加SA对不同植物的调控浓度可能相近。在本实验中，外源施加SA对水稻根系的发育和生长的调节与拟南芥中有很大差别，这说明，虽然SA在不同植物中的调控浓度接近，但是在不同的植物中，调控的机制可能有差别，因此，对植物形态影响的结果也会有不同。
生长素的合成和运输影响了生长素在植物体内的积累和分布。例如水稻中过表达OsPIN2基因，引起生长素的过度积累，从而增加了水稻的分蘖数和降低了株高等，最终影响了水稻的形态 [19]。本实验中，采用DR5::GUS生长素报告基团显示，低浓度的SA处理水稻幼苗2天和4天降低了初生根的生长素积累，而高浓度的SA处理水稻幼苗引起初生根中生长素的过度积累，从而调控了初生根的根长、不定根的数目和根长，以及侧根数目和侧根根长，最终影响了水稻根的形态。低浓度SA和高浓度SA处理对不定根的影响及侧根的影响，也与生长素的积累和分布有关，需要进一步实验探究。本实验进一步分析了生长素合成和运输基因在低浓度SA和高浓度SA处理时转录水平的变化，部分基因随处理发生不同程度的改变，具体调节机制需要进一步探究。
总之，本实验发现外源添加不同浓度的SA调节了水稻的生长状态，其影响与SA的浓度，以及处理时间相关。DR5::GUS生长素报告基团表明，SA对水稻生长的调节是通过调节生长素在植物内的积累和分布实现的。
NOTES
*通讯作者。