1. 引言
失眠是最常见的睡眠障碍表现之一。失眠患者人数每年都在不断增长，严重影响患者的工作效率和生活质量。目前，失眠的机制还不是很明确，临床缺乏理想的失眠治疗药物。中医药在失眠治疗上有一定的优势，疗效也得到认可。中医学认为失眠多肝郁 [1]，治疗应以疏肝为主，安神为辅。松郁安神方是黄俊山教授临床治疗失眠的经验方，对肝郁失眠患者的疗效确切。该方治疗失眠的药理机制还不是很明确。课题组近期研究发现，松郁安神方对失眠大鼠前列腺素D2 [2]、褪黑素 [3] 的释放以及海马区CREB的基因表达 [4] 和5-HT1A受体介导的cAMP/PKA信号通路 [5] [6] 具有调节作用。但是，该方对失眠大鼠基底核腺苷受体和多巴胺受体是否具有调节作用还未知。因此，本研究通过失眠大鼠模型，给予松郁安神方和西药阿普唑仑进行治疗，以失眠大鼠基底核腺苷受体和多巴胺受体途径为药理机制切入点，探讨松郁安神方治疗失眠的药理机制。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
SPF级雄性SD大鼠60只，体重220 ± 10 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(许可证号：SCXK(沪)20017-0005)。饲养于福建省中医药科学院动物实验室，恒温(22℃ ± 1℃)和12:12固定明暗节律的安静环境下，自由摄取食物和水 [2]。本研究所涉及动物实验过程遵守动物福利，经我院实验动物福利伦理委员会批准。
2.2. 实验药物
松郁安神方(SYF)由甘松10 g，郁金15 g，玫瑰花
10 g
，酸枣仁15 g，生龙骨30 g (先煎)，珍珠母30 g (先煎)，夜交藤30 g，丹参15 g组成 [2]。以上中药饮片均购于福州鹭燕医药有限公司。由药剂室一次性煎煮，分装后−20℃保存。阿普唑仑片(批号：20190417)，购于福建省第二人民医院。
2.3. 主要试剂和仪器
抗体Adenosine A2A-R (7F6-G5-A2) (Santa Cruz: sc-32261)和D2DR Antibody (B-10) (Santa Cruz: sc-5303)购于Santa Cruz公司。内参GAPDH (14C10) Rabbit mAb (CST: #2118S)；二抗Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (CST: #7076S)和Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (CST: #7074S)购于CST公司。对氯苯丙氨酸(PCPA) (货号：C6506-25G)购于Sigma公司。酶标仪(美国BioTek，800TS)。
2.4. 失眠大鼠模型的建立方法
失眠大鼠模型的建立参照文献报道方法 [7]：将PCPA溶于弱碱性生理盐水，配置成300 mg/kg混悬液。连续给实验大鼠腹腔注射PCPA混悬液2天。使用该方法建立失眠大鼠模型，简单易操作，目前比较公认。模型成功的实验大鼠出现昼夜节律消失，白天活动增多，睡眠减少，易惊觉，体重减轻，毛色欠光泽等整体观察异于正常组的表现。
2.5. 实验大鼠的分组、给药及取材
除对照组外，造模成功后的实验大鼠随机分成以下几组：模型组、SYF低剂量组、SYF高剂量组和西药阿普唑仑组，每组大鼠12只。SYF低剂量组按8.5 g/kg灌胃给药，SYF高剂量组按17 g/kg灌胃给药 [5]。阿普唑仑用生理盐水配置成0.04 mg/kg混悬液，灌胃给药。对照组和模型组给予同等体积的生理盐水灌胃。以上各组，均按15 mL/kg体质量灌胃，1次/天，共1周。治疗结束后，戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血后，剪开头皮，揭去颅骨和硬脑膜，迅速取出大鼠的整个脑组织。用预冷的生理盐水溶液冲洗干净，置于−80℃保存 [8]。
2.6. 腺苷A2AR受体和多巴胺D2DR受体蛋白表达水平检测
采用Western blotting实验方法进行检测。将大鼠基底核组织剪成细小的碎片，按20 mg/200 μL加入RIPA裂解液，经低温超声粉碎后12,000 r/min离心5 min，取上清液进行蛋白定量，95℃变性。然后，进行PAGE凝胶电泳，浓缩胶80 V，30 min和分离胶120 V，90 min。电泳结束后，电源300 mA，120 min转膜。转膜后，使用封闭液室温封闭PVDF膜1 h。弃去封闭液，加入一抗A2AR (1:200)、D2DR (1:200)或GAPDH (1:1000)，4℃摇床反应过夜。次日，经PBST洗膜3次后加入HRP标记的二抗(1:2000)室温孵育1 h，洗膜后加入ECL显色，读取图像。实验重复3次。应用Image J分析软件对图像进行半定量分析 [8]。
2.7. 统计学方法
所有实验数据使用SPSS20.0软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异存在统计学意义。实验结果用图显示。
3. 结果
3.1. 实验过程中大鼠的一般状态表现差异
实验过程中对照组的实验大鼠，睡眠活动正常，饮食正常，体重缓慢增加，毛色有光泽，其他生理状况正常。在造模和用药期间，模型组大鼠的饮食减少，白天和夜间活动比对照组增加，睡眠减少，精神状态差，烦躁，皮毛颜色欠光泽，体重增长与对照组比较有显著差异(P < 0.01) (图1)。SYF高剂量和低剂量组大鼠的饮食、睡眠等生理活动与对照组相似，阿普唑仑组大鼠昼夜活动趋于正常，毛色欠光泽，精神状态没有SYF治疗组好。与模型组大鼠体重比较，SYF高剂量和低剂量组均具有显著性差异(P < 0.01)，阿普唑仑组也具有统计学差异(P < 0.05) (图1)。SYF高剂量同阿普唑仑组大鼠体重比较差异显著(P < 0.01)，SYF低剂量同阿普唑仑组大鼠体重比较具有统计差异(P < 0.05) (图1)。中药复方SYF在改善失眠引起的症状上优于西药阿普唑仑。
注：与对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.01，◇P < 0.05；与阿普唑仑组比较，◆P < 0.01，*P < 0.05。
Figure 1. Comparison of weight changes of rats in each group before and after treatment
图1. 治疗前后各组大鼠体重变化比较
3.2. SYF对失眠大鼠基底核组织中腺苷A2AR表达的影响
为了进一步验证中药复方SYF是否对失眠大鼠基底核腺苷受体的表达水平有影响。我们运用Western Blotting实验对各组大鼠基底核组织中腺苷A2AR的表达进行检测。结果见图2和图3所示：失眠大鼠模型组基底核组织中腺苷A2AR的表达水平相比较正常对照组被显著的下调(P < 0.01)。西药阿普唑仑组、SYF高剂量组和低剂量组实验大鼠基底核组织中腺苷A2AR的表达水平与失眠大鼠模型组比较，均被显著性的上调(P < 0.01)。SYF高剂量组同阿普唑仑组比较，腺苷A2AR的表达水平具有统计学差异(P < 0.05)。SYF低剂量同阿普唑仑组腺苷A2AR的表达水平相比较差异显著(P < 0.01)。
Figure 2. Effect of SYF on A2AR protein expression in basal ganglia of rats
图2. SYF对大鼠基底核组织A2AR蛋白表达的影响
注：与对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.01；与阿普唑仑组比较，*P < 0.05，△P < 0.01。
Figure 3. Semi-quantitative analysis of A2AR protein expression in basal ganglia of rats in each group
图3. 各组大鼠基底核组织A2AR蛋白表达半定量分析
3.3. SYF对失眠大鼠基底核组织中多巴胺D2DR表达的影响
同时，我们还通过Western Blotting实验检测了SYF是否对失眠大鼠基底核多巴胺受体也具有调节作用。检测结果如图4和图5所示：失眠大鼠模型组基底核组织中的多巴胺D2DR表达水平同正常对照组相比被显著上调(P < 0.01)。SYF高剂量组、低剂量组和阿普唑仑组大鼠基底核组织中多巴胺D2DR的表达水平与失眠大鼠模型组比较被显著下调(P < 0.01)。SYF高剂量组同阿普唑仑组多巴胺D2DR的表达水平相比较无统计学差异(P > 0.05)，SYF低剂量组同阿普唑仑组和SYF高剂量组多巴胺D2DR的表达水平比较均具有显著性差异(P < 0.01)。
4. 讨论
睡眠和觉醒受到复杂的生理机制调控，该机制目前还没有完全被揭示。偶尔性的失眠会造成第二天疲倦和动作不协调，经过人体自身的休息调整，很快会恢复。但如果是长期性的失眠，会给人带来严重的负面效应 [9]。因此，加深中医药治疗失眠的机制研究，寻求更有效的方法来防治失眠具有一定的科学意义。本研究通过动物实验也发现了，中药复方SYF在改善由失眠引起的症状上比西药阿普唑仑效果好，这也就证实了中医药治疗失眠的优势。
Figure 4. Effect of SYF on D2DR protein expression in basal ganglia of rats
图4. SYF对大鼠基底核组织D2DR蛋白表达的影响
注：与对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.01；与阿普唑仑组比较，▲P < 0.01；与SYF高剂量组比较，△P < 0.01。
Figure 5. Semi-quantitative analysis of D2DR protein expression in basal ganglia of rats in each group
图5. 各组大鼠基底核组织D2DR蛋白表达半定量分析
基底核(Basal ganglia, BG)在睡眠与觉醒的转换中起着重要的作用。基底核由纹状体、苍白球、丘脑下核和黑质组成，其中高表达腺苷A2A受体和多巴胺D2受体 [10]。腺苷作用于腺苷A2A受体抑制觉醒，促进睡眠。多巴胺作用于多巴胺D2受体抑制睡眠，促进觉醒。两者起着相反的调控睡眠和觉醒的作用。因此，我们借助失眠大鼠模型，以基底核腺苷和多巴胺受体途径为切入点，探讨SYF治疗失眠的药理机制。
腺苷是一种主要的内源性促睡眠物质，腺苷及其受体作为镇静催眠的新靶点具有很好的开发前景 [11]。腺苷通过不同的腺苷受体发挥特定的作用。研究发现，咖啡因可以阻断伏隔核中腺苷对其A2A受体的作用，进而引起较强觉醒效应 [12]。激活腺苷A2A受体阳性神经元，可引起NREM睡眠时间增加。相反情况下，抑制腺苷A2A受体阳性神经元活性，使得睡眠时间缩短 [13]。还有文献报道，使用腺苷A2A受体激动剂激活腺苷A2A受体，可以诱导实验大鼠生理性睡眠 [14]。本研究通过实验发现：失眠大鼠基底核腺苷A2AR的表达水平相比较对照组被显著下调(P < 0.01)，中药复方SYF高剂量组和低剂量组均能够显著上调失眠大鼠基底核腺苷A2AR的表达水平(P < 0.01)。说明SYF能够激活失眠大鼠基底核腺苷A2AR受体，促进睡眠。
多巴胺是典型的促觉醒类神经递质，多巴胺及其受体在失眠的机制研究中也是非常重要的靶点之一。文献报道，多巴胺D2R受体在维持觉醒中起重要作用 [15]。基因敲除多巴胺D2受体的动物觉醒时间明显减少，REM和NREM睡眠时间增加 [16]。本研究发现：失眠大鼠基底核多巴胺D2DR的表达水平相比较对照组显著上调(P < 0.01)，中药复方SYF高剂量组和低剂量组均能够显著下调失眠大鼠基底核组织中多巴胺D2DR的表达水平(P < 0.01)。说明SYF能够抑制失眠大鼠基底核多巴胺D2DR受体，促进睡眠。
本研究利用失眠大鼠模型，证明了松郁安神方在改善由失眠引起的症状上优于西药阿普唑仑。该方能够通过影响失眠大鼠基底核腺苷A2AR受体和多巴胺D2DR受体的表达水平，改善其失眠症状，进而丰富了中医药防治失眠的药理机制。但是，中药复方成分复杂，具有多靶点作用。具体有哪些主要成分可以作用于基底核腺苷受体和多巴胺受体系统，以及更深一步的调控机制还不是很清楚，这些问题还需要继续探索。
5. 结论
综上所述，松郁安神方能够通过影响失眠大鼠基底核腺苷A2AR受体和D2DR受体的表达，改善由失眠引起的症状。关于该方是通过什么信号通路调控腺苷A2AR受体和D2DR受体的机制，以及其主要的药效成分是什么还需要更深入的研究去证实。
基金项目
国家自然科学基金项目(81703843)。
NOTES
*通讯作者。