1. 引言
胃疡宁丸是一种著名的中成药，具有温中散寒、理气止痛、制酸止血的功效，临床上用于治疗慢性胃炎、胃溃疡、胃胀、胃痛、胃酸过多等疾病 [1]。随着现代医学的发展，人们发现胃疡宁丸具有多种药理活性，包括抗炎、抗菌、止痛、抗胃溃疡、抗幽门螺旋杆菌等 [2] [3] [4] [5]。与各种治疗胃病的西药(埃索美拉唑镁、吗丁啉、生胃酮、西咪替丁等)相比，胃疡宁丸具有毒副作用低、药效持久、不易复发等优点 [6]，在治疗各种慢性胃病，特别是慢性胃炎、胃溃疡等方面，表现了出非常好效果。
胃疡宁丸由乌药、炒山药、制白术、白及、青皮等十几种中草药加工而成 [7]。其中，乌药来自于樟科山胡椒属植物乌药的块根，具有理气止痛、温肾散寒的功效 [8]。研究表明，乌药中含有一定量的去甲乌药碱(图1)。去甲乌药碱是一种β2受体激动剂，具有强心、降血压、抗炎镇痛、抗肿瘤等多种药理活性 [9] - [14]。动物实验表明，去甲乌药碱对大鼠心脏具有显著的保护作用 [15]，能够明显增强心衰大鼠的心肌收缩力，同时对炎症细胞和肿瘤细胞具有较好的抑制效果 [16]，这说明去甲乌药碱是胃疡宁丸中的一种关键活性物质，对于胃疡宁丸的多种药理活性至关重要。本实验拟采用高效液相色谱法分析测定胃疡宁丸中去甲乌药碱的含量，通过优化色谱条件，建立一种快速、简便、可重复的检测方法，广泛用于测定胃疡宁丸及同类产品中去甲乌药碱的含量，这有利于进一步研究去甲乌药碱在胃疡宁丸中起到的关键药理活性，且对于中成药胃疡宁丸生产过程中的质量控制具有重要意义。
Figure 1. Chemical structure of Higenamine
图1. 去甲乌药碱结构图
2. 仪器与试药
2.1. 仪器
梅特勒ME204E电子天平，安捷伦Agilent1260高效液相色谱仪，昆山舒美KQ-500B型超声波清洗器，德国西门子UltraClear超纯水系统。
2.2. 试药
胃疡宁丸(广州白云山陈李济药厂有限公司)，去甲乌药碱对照品(上海抚生实业有限公司)，色谱级乙腈(阿拉丁)，超纯水(自制)。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
本实验色谱柱选用安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18液相色谱柱，150 × 4.6 mm，3.5 μm；流动相为乙腈–水(85:15)，水相中含有0.1%的甲酸；检测波长为214 nm，柱温25℃，进样量10 μL，流速为0.5 mL/min。
3.2. 溶液的配制
3.2.1. 对照品溶液的配制
准确称取去甲乌药碱对照品，置于容量瓶中，用甲醇溶解、稀释，配制成1.0 g/L的标准溶液，于−18℃闭光保存。使用时用移液管吸取一定量该对照品溶液，用3.1所述的流动相乙腈–水(85:15)溶液稀释。
3.2.2. 供试品溶液的制备
取胃疡宁丸1.0 g，加入硅藻土2 g，研磨，转移到锥形瓶中，加入30 mL甲醇，于超声波清洗器中超声1 h，过滤，滤饼中再次加入30 mL甲醇，于超声波清洗器中超声1 h，过滤，合并所得滤液，减压浓缩，所得固体用3.1所述的流动相乙腈–水(85:15)溶液溶解，并稀释定容至50 mL得供试品溶液，使用前取少量供试品溶液用微孔滤膜过滤。
3.2.3. 阴性供试品溶液的制备
按照胃疡宁丸中药配方的比例和制备工艺，制备不含乌药的胃疡宁丸阴性对照样品，按照3.2.2的方法制备阴性对照品溶液。
3.3. 专属性实验考察
取去甲乌药碱对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各10 μL，按照3.1所述的色谱条件，做HPLC谱图。如图2所示，在该液相色谱条件下，去甲乌药碱的保留时间是8.41 min，与相邻的化合物峰能够明显的分离，且在阴性供试品溶液中几乎不含去甲乌药碱。
Figure 2. HPLC chromatogram of reference solution of Higenamine (A), test solution (B), and negative test solution (C)
图2. 去甲乌药碱对照品溶液(A)、供试品溶液(B)和阴性供试品溶液(C)的液相色谱图
3.4. 线性关系考察
精确称量去甲乌药碱2.4 mg，用甲醇溶解，容量瓶定容至10 mL，得240 μg/mL的待测溶液。取该待测溶液，配制成浓度为2.4，12.0，24.0，36.0，48.0，96.0 μg/mL的标准溶液，各取10 μL，进样，测定去甲乌药碱的HPLC谱图，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，得去甲乌药碱的回归方程：Y = 29456X + 24795，r = 0.9994，结果表明，去甲乌药碱在2.4~96.0 μg/mL的进样浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系。
3.5. 精密度试验
用移液管移取步骤3.2.1中所配制的去甲乌药碱对照品溶液3 mL，置于容量瓶中，定容至10 mL，取10 μL，进样，测定去甲乌药碱的峰面积，连续测定6次，结果表明，去甲乌药碱峰面积的RSD值是1.98%，符合实验要求。
3.6. 稳定性试验
取步骤3.2.2制备的供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10 h取样10 μL，测定去甲乌药碱HPLC谱图的峰面积，计算RSD值为0.88%，说明该溶液在10 h内具有较好的稳定性。
3.7. 重复性试验
取同一批次的胃疡宁丸6份，按照步骤3.2.2中的方法制备供试品溶液，按照2.1所述的色谱条件，做HPLC谱图，测定去甲乌药碱的峰面积，计算RSD值为2.37%，表明该测试方法具有较好的重复性。
3.8. 加样回收率实验
取同一批次的胃疡宁丸1.0 g，加入硅藻土2 g，研磨，转移到锥形瓶中，按照步骤3.2.2中的方法，加入甲醇，超声提取，合并所得滤液，减压浓缩，向所得固体中加入10 μL的去甲乌药碱标准品溶液(浓度1.0 g/L)，用3.1所述的流动相乙腈–水(85:15)溶液溶解，并稀释定容至10 mL，按照3.1所述的色谱条件，做HPLC谱图，重复三次，计算平均回收率。重复上述实验，分别加入20 μL、30 μL的去甲乌药碱标准品溶液(浓度1.0 g/L)，计算平均回收率，结果如表1所示，加样回收率平均值为99.33%，符合药典要求。
Table 1. Recovery rate of Higenamine
表1. 去甲乌药碱的加样回收率
3.9. 胃疡宁丸样品中去甲乌药碱的含量
取不同批次的胃疡宁丸6份，按照步骤3.2.2中的方法制备供试品溶液，按照3.1所述的色谱条件，做HPLC谱图，测定去甲乌药碱含量，结果如表2所示。结果表明，不同批次的胃疡宁丸中去甲乌药碱的含量均在9 μg/g左右，去甲乌药碱的平均含量为9.348 μg/g。
Table 2. Content of Higenamine in Weiyangning pills
表2. 胃疡宁丸样品中去甲乌药碱的含量
4. 结果与讨论
本文采用传统的高效液相色谱技术，建立了胃疡宁丸中去甲乌药碱的含量测定方法。该方法操作简便，具有较高的精密度、较好的稳定性和实验可重复性，可广泛用于其它类中成药中去甲乌药碱含量的测定，这为中成药有效成分的快速分析和质量控制提供了可选择的、简易且精密度高的分析手段。测定结果表明，胃疡宁丸中去甲乌药碱含量的平均值为9.348 μg/g，这说明去甲乌药碱很可能在胃疡宁丸的某些药理活性中起到了非常重要的作用，例如强心、降血压、抗炎镇痛、抗肿瘤等，这对于进一步研究胃疡宁丸的多种药理活性至关重要。
NOTES
*通讯作者。