1. 前言
胚胎时期是生命最脆弱的时期，早期认为胚胎只能被动地响应环境的变化。进一步的研究表明，胚胎具有主动响应环境变化的行为调节能力 [1]。玛瑞曲颈龟(Emydura macquarii)的卵在沙子下未破壳而出时，上层靠近太阳晒热土壤的卵比下层较冷土壤处的卵要发育得快，但是这些发育中的胚胎能通过信息交流感知其它胚胎发育的进度，从而改变自身的步调，同步孵化 [2]，达到躲避天敌捕食、维持种群数量的目的。无独有偶，类似于玛瑞曲颈龟的这类胚胎间的信息交流现象在绿海龟(Chelonia mydas) [3]、鸟类 [4] 中普遍存在。此外，绿海龟还会利用巢穴的深度所导致的温度梯度控制其后代雌雄比例，从而保证物种的延续能力。陆生龟类与海龟相比，其孵化的自然环境更加多样且复杂 [5]，产卵频率及产卵量更低 [6]，卵以及稚龟的天敌种类更多，从而导致众多陆生龟类处于濒危或极度濒危的状态。
目前，有关温度、湿度、光照等非生物因子影响稚龟健康状况的研究已取得大量成果。例如在相对较高的温度下(适宜范围内)，胚胎对卵黄的利用率 [7] 以及对卵壳中矿物质元素的摄取量 [8] 会相对较高，胚胎的发育进程加速 [9]，稚龟的健康状况也会较好 [7]。孵化湿度对稚龟的体重、个体大小及运动能力都有显著影响 [10]。但是有关陆生龟胚胎信息交流这类生物因子对胚胎发育的影响未见报道。
因此，本实验从红耳龟的胚胎入手，通过对胚胎心率的测定及不同组龟卵孵化率的统计，以探究出陆生龟类胚胎个体间是否会互相影响，促进胚胎的发育进度达到同步孵化。为进一步研究陆生龟胚胎的信息交流提供基础数据。
2. 材料与方法
2.1. 材料
试验采用购自海口东山鸿旺水产养殖场的产于同一天的红耳龟卵150枚，龟卵的形态学指标没有显著性差异。在实验室短暂静置稳定后用于分组孵化。
2.2. 实验器材
SPS-250智能生化培养箱购自宁波海曙赛福实验仪器厂；0~150游标卡尺购自上海申韩量具有限公司；心率仪(NEWTON ABBOT-ENGLAND BUDDY01)；电子天平。
2.3. 实验方法
2.3.1. 分组孵化
Figure 1. Schematic diagram of group incubation
图1. 分组孵化示意图
如图1所示，将150枚龟卵随机均分为I、II两组(各75枚)，分别将I组和II组置于27℃和31℃的孵化箱中恒温孵化。15 d后，从I、II组中各随机取17枚卵组合为第III组，将第III组(34枚)放置于27℃的孵化箱中恒温孵化至破壳，I组(58枚)和II(58枚)组依旧分别放置于27℃和31℃的孵化箱中恒温孵化。
孵化30 d后，从I、II组中各随机取17枚卵组合为第IV组，将第IV组(34枚)放置于27℃的孵化箱中恒温孵化出壳，I组(41枚)、II组(41枚)依旧分别放置于27℃、31℃的孵化箱中恒温孵化出壳，整个孵化期间严格控制四组的光线、湿度保持一致。
2.3.2. 胚胎心率测量
在胚胎孵化期间，每隔15天(理想状态下的四分之一孵化期)对所有胚胎的心率进行测量并统计。
3. 实验结果
3.1. 红耳龟受精卵孵化率
如表1，通过对各组孵化率情况进行差异显著性分析可知，第III组总孵化率为83.3%，显著高于其他各组；其中来自I组中的卵孵化率为87.5%，与第I组相比具有差异显著性(P < 0.05)，与第IV组中来自第I组卵的孵化率无显著差异(P > 0.05)，来自II中的卵孵化率为78.5%，显著高于第II组和第IV组中来自第II组卵的孵化率(P < 0.05)；第IV组总孵化率为58.6%，其中来自I，II组中的卵孵化率分别为75.0%和38.4%，与第I组和第II组卵的孵化率无显著差异(P > 0.05)。
Table 1. Statistics of hatching rate
表1. 孵化率情况统计表
Table 2. Statistics of specific shell-breaking time of juvenile tortoise
表2. 稚龟具体破壳时间统计表
3.2. 红耳龟受精卵孵化期
由表2可知，第I组的孵化期为第90至102天，其中第95至98天为孵化高峰期。第II组的孵化期为第62至64天，集中在第63和64两天出壳。第III组的孵化期为第76至88天。第IV组的孵化期为第71至92天，该期间破壳数量分布极为分散。通过比对III、IV组中各稚龟来源发现，第III组中来自I组卵的孵化期略短于第I组卵的孵化期，来自第II组卵的孵化期显著长于第II组卵的孵化期，同时，来自第II组的卵孵化期略短于来自第I组的卵，但其来自I、II的卵孵化期有一定的时间交叉。第IV组中来自第I组卵的孵化期略短于第I组卵，来自第II组卵的孵化期长于第II组卵，且显著短于来自第I组卵的孵化期，两者之间几乎不存在时间交叉。
3.3. 红耳龟受精卵心率检测
3.3.1. 心率值总体情况
在孵化期间多次进行心率值测量发现，可根据心率情况将胚胎发育进度人为地概括为五个阶段：
① 无心率阶段，该阶段心率值为0次/分(下面简称为“一阶段”)；
② 心率值不断波动无法准确测量阶段(下面简称为“二阶段”)，该阶段心率值在100~500次/分之间不断跳动，无定值，无法测量；
③ 心率值极高却稳定可测量阶段(下面简称“三阶段”)，该阶段心率值稳定在100~500次/分之间的某一数值，可测量；
④ 心率值较低且稳定可测量阶段(下面简称“四阶段”)，该阶段心率值稳定在35~65次/分之间的某一数值，可测量；
⑤ 心率值较高且稳定可测量阶段(下面简称“五阶段”)，该阶段心率值稳定在78~92次/分钟之间的某一数值，可测量。
注：① 图中颜色深浅代表该心率区间内胚胎数量的多少，颜色越深，胚胎数量越多。② 第III组和第IV组的图分为两列，左列与右列分别表示该组中来自第I组和来自第II组的胚胎心率情况。
Figure 2. Changes of heart rate values in each group
图2. 各组心率值变化情况图
3.3.2. 红耳龟胚胎心率值变化情况
若以时间为标准，每15天作为一个区间，可将胚胎的孵化时间分为四个时期(即一期，二期，三期，四期分别对应孵化的第1~15天，第16~30天，第31~45天，第46~60天)。结合图2以及3.2.1的内容可得出：
Table 3. Comparison of embryo development time and development stage
表3. 胚胎发育时间与发育阶段比对表
Table 4. Statistics of heart rate values in each group
表4. 各组心率值有无情况统计表
由表4可知，第I组中有心率的胚胎占卵量百分比在一期极低，二期显著升高，三、四期接连有所降低，但数据一直保持在中等偏上水平。第II组中有心率的胚胎占卵量百分比在一期相对I组较高，之后则波动降至极低水平。第III组中有心率的胚胎占卵量百分比在二期极高，三、四期略微下降但仍处于极高水平。第IV组中有心率的胚胎占卵量百分比在三、四期无变化，处于中等水平。
4. 分析与讨论
4.1. 红耳龟受精卵孵化率情况分析
从统计结果可知，第I组和第II组受精卵孵化率都比较低。据李新民 [11] 研究，红耳龟最适孵化温度是30℃~33℃，此温度有利于红耳龟的胚胎发育；而容银燕等 [9] 研究发现低温导致胚胎发育减缓或停滞而过高温度虽能提高胚胎发育速度但易对胚胎造成损伤，导致其畸形和死亡。第III组受精卵因为前1/4期所处的环境不同，虽然同是在27℃环境下孵化，整体孵化率高于I、II两组。Ricky-John Spencer [2] 在研究中发现，玛瑞曲颈龟孵化过程中胚胎发育较快的受精卵，可以释放一些信息因子刺激发育比较慢的胚胎，加快胚胎发育的进度，可能因此使整体的孵化率有所提高。
第IV组孵化率较低且来源不同的龟卵孵化率差距较大，可能是由于受精卵混合时间较晚，胚胎间相互影响程度降低，前期孵化温度成为影响孵化率的主要因素 [5]，因此来自I、II组卵的孵化率比较接近第I组和第II组的孵化率。
4.2. 红耳龟受精卵孵化期变化分析
实验结果可知，第II组卵破壳用时远短于其他组。而第I组卵破壳用时最长，说明在一定范围内，高温会使胚胎发育速度加快 [10]。
第III组卵整体集中在第76至88天破壳，且来自第I、II组的卵的孵化期有所重合，研究报道孵化期胚胎之间存在信息交流和能量交换 [12]，如果通过分散能量的热传导方式不可能导致个别来自低温组的卵孵化进度领先，且由于混合时间较早，热传导所分散的能量带来的影响极小。因此，推测发育较快的胚胎与发育较慢的胚胎混合孵化时，发育快的胚胎通过某种生物信号刺激发育慢的胚胎，加快其发育速度，从而趋于同步孵化。
第IV组卵孵化期跨度较长，且中间多处有明显间隔。其中来自第II组的卵由于受到孵化温度的影响，孵化时长明显长于第II组。来自第I组的卵整体领先于第I组可能是因为来自第II组的胚胎通过释放生物信号加速了其整体的发育速度 [12]。
4.3. 红耳龟胚胎发育期心率值总体变化趋势分析
研究报道鸟类和海龟受精卵孵化时，不同时期心率有不同的特点，心率值直接反映胚胎发育的进度 [13]。通过心率检测结果可见，红耳龟胚胎心率呈现阶段性变化，推测不同阶段心率变化的原因：
一阶段：在孵化初期，胚胎进入有丝分裂，还未分化出心脏，因此在使用心率仪测定心率时无法测出心率值；二阶段：卵内发育出心脏，产生了心率，但此时的心脏自律性较差，受外界刺激高度敏感，因此在测量过程中心率值会不断波动无法准确测量；三阶段：神经系统发育不完全，胚胎新陈代谢旺盛，心脏自律性很高；四阶段：在神经系统的调控下胚胎心率逐渐趋于正常龟类心率值；五阶段：孵化末期，稚龟即将破壳，短时间内需要消耗较多的营养物质提供能量破壳，心率值又有所偏高。
4.4. 受精卵心率变化分析
从实验结果可知，第I组胚胎心率出现较晚，而第II组心率出现的较早。耿军 [14] 的研究认为高温能够增加幼体心率从而缩短孵化期，因此第I组心率出现较第II组晚，可能是所处的孵化环境温度较低，胚胎发育的进度较第II组慢。
从表3可知，第III组从二期始，其中来自第II组胚胎心率的五个阶段明显降速，最终与来自第I组胚胎的进度几乎相同，可能是因为孵化温度的降低。徐意 [15] 在荒漠沙蜥(Phrynocephalus przewalskii)胚胎的研究中及Birchard G F等 [16] 在拟鳄龟(Chelydra serpentina)的研究中也得到了相同结论，即环境温度升高会导致胚胎心率加快。来自第I组胚胎心率的五个阶段有所提速，相比于第I组的胚胎更快地进入到了四阶段，孵化期比第I组孵化期有所缩短。提速的原因可能主要是来自高温组的胚胎所产生的信号加速了低温组胚胎的发育进度。在玛瑞曲颈龟的研究中Mcglashan JK [12] 认为不同发育进程胚胎间的气体信号交换，促进了发育较慢的胚胎的新陈代谢，从而使两者达到同步孵化。第IV组从三期开始，其中来自第I组胚胎心率整体的进度几乎没有变化，在四期之后才有所提速，只有极少数个体心率值向五阶段加速发育较为明显，可能是与第I组的胚胎发育进度差距过大，变化不明显。
从统计结果来看，各组稚龟的孵化时长与其心率值情况完全契合，说明心率值直接用于反映胚胎发育进度在红耳龟上有较高的可靠性。若准确地将心率值情况与孵化时间相匹配，在日后的龟类研究及养殖中，可通过较为简便的心率测量方法确定龟类所处的发育阶段，及时调整孵化环境，从而一定程度控制龟类胚胎的生长发育。
通过各项指标检测，认为在陆生龟胚胎发育过程中，可能也存在信息交流，可使不同发育进程中的胚胎趋于同步，从而提高了稚龟破壳时的存活率，对于维系物种繁衍和进化起到了重要作用。