1. 引言
我国农田土壤重金属污染日益严重，环境质量明显下降，对农产品及相关产业安全带来巨大威胁，其中Ni、Cu和Zn分别超标4.8%、2.1%和0.9% [1]。在矿区附近的土壤污染情况则更为严重 [2]。而将被重金属污染的生物质用作厌氧发酵是一种经济高效的处理方法 [3] [4]。厌氧发酵生产制得的沼肥是一种营养成分丰富的有机肥，以往的许多研究也证明了施加沼肥可以促进作物、果树等的生长发育 [5] [6] [7]。然而，生物质含有的重金属会在发酵之后富集到沼液和沼渣之中 [8]，影响沼肥的施用。
部分重金属既是生物生长所必需的元素，又是抑制生物生长的物质。Cu、Zn、Fe对种子生长主要表现为抑制作用，仅在较低浓度下对种子发芽有一定促进作用，一般情况下浓度都不超过100 mg/L。黎建玲等 [9] 人的研究显示在不同浓度Cu的胁迫下，南瓜种子萌发参数呈现出先升高后降低的趋势，过量的Cu制约了植物的生长发育。陈丽丽等 [10] 的研究显示当Zn的浓度大于50 mg/L时小麦种子的活力指数均小于对照组。郑爱珍的研究也表明当Cu、Zn的浓度大于50 mg/L时，玉米种子的萌发即受到抑制 [11]。此外，另有研究显示在Cu、Zn复合胁迫下，包菜种子的各项发芽数据均显著低于对照组 [12]。薛建福等 [13] 的研究发现较高浓度(Fe ≥ 400 mg/L)时，浸种对叶绿素a和叶绿素b含量有一定抑制作用。含有Ni的培养液对种子的刺激较大。当Ni的浓度大于1.5 mg/L时，含Ni培养液即对水稻和白菜种子表现为抑制作用 [14]。Co并非生物生长的必须元素，即使浓度低为0.03 mmol/L，水稻种子也表现为抑制状态 [15]。李黎等的研究表明随着浓度提高，玉米种子的发芽率、发芽势均下降，且玉米种子相对其他植物对Co的富集相对较少 [16]。
当前我国许多地方的畜禽养殖场在饲养过程中使用了大量含有Cu、Zn等的微量元素 [17]，且农田重金属污染情况严重，产出的沼肥也因此被重金属所污染。因此，研究重金属胁迫下沼肥对植物的生长发育已刻不容缓。以往的实验往往都是单一的添加金属盐溶液或培养液 [12] [13] [16]，关于利用沼液浸种和沼渣施肥条件下金属胁迫影响的相关研究还较少。该研究以更贴近实际的研究方法，提供相对更接近现实的参考资料。
本研究分析了不同金属胁迫条件下的沼肥对植物生长的影响，以减少盲目施用沼肥造成的作物、果树等减产，减少沼肥的滥用造成的土壤重金属污染。本研究以牛粪作为接种物，矿区的污染紫花苜蓿作为底物，在不同组添加不同种类的金属进行厌氧发酵制得含有不同金属的沼肥。以北方常见的粮食作物玉米的种子进行发芽和苗期发育实验。通过对沼液浸种、施加沼肥后玉米的发芽率、活力指数等的研究，旨在了解不同金属胁迫下植物的生长过程的影响，为今后规范厌氧发酵、有机肥生产提供相应的参考依据，为减轻植物和土壤的重金属污染提供数据支持。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
厌氧发酵底物苜蓿草采自河北张家口某废弃铁矿。采得的苜蓿草在实验室风干后磨成粉末，并过60目标准土壤筛。接种物为张家口某奶牛场的储备牛牛粪，采回后置于4℃冰箱备用。各金属盐试剂均为分析纯。
实验种子为山东富易公司购得的玉米(Zea mays L.)种子郑单958。选取颗粒饱满、大小均一、健康无病等各项指标良好的种子，用去离子水清洗酒精消毒后备用。营养土自北京某花鸟市场购得，于阴凉避光处存放。
2.2. 实验方法
本实验以苜蓿草和牛粪(1:2)作为原料进行厌氧发酵。T0组不添加额外金属，T1~T9组分别添加不同种类的金属盐模拟各种金属污染，各组具体添加的金属及含量如表1所示。发酵反应在中温条件下(37.0 ± 1.0℃)进行。发酵罐有效容积为300 mL，发酵体系总固体浓度为8%。发酵周期32天，每天测定产气量以确保发酵体系的稳定。制得的沼肥在8000 r/min下离心5 min，分离得到沼液和沼渣以供后续实验使用。
2.2.1. 沼液实验
去离子水(CK)浸种作为对照，将玉米种子在稀释一倍的各组(T0~T9)沼液中浸种18 h。取出洗净后置于恒温恒湿培养箱(HWS-160，宁波江南仪器厂)中培养7天，每个培养皿中盛放20粒种子，每组3个重复。培养箱设定条件为25.0℃ ± 1.0℃，相对湿度60% ± 5%，遮蔽光照。每天补充适量去离子水，并记录各组种子的发芽数(胚芽长至种子的一半长度即视为发芽)。培养7天后分别测量种子的胚芽、胚根的长度和重量 [18]。种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数 [19] 依据如下公式计算：
发芽率 = (前7天发芽的种子数/供试种子数) × 100% (1)
发芽势 = (前3天发芽的种子数/供试种子数) × 100% (2)
发芽指数GI =
(Gt为第t日种子发芽数，Dt为发芽天数) (3)
活力指数 = 苗长度 × 发芽指数 (4)
2.2.2. 沼渣实验
以纯营养土作为对照(CK)，将各组沼渣(T0~T9)与营养土以1:9的比例混合均匀置于盆中静置1天。每盆土壤中播种5粒玉米种子，覆土4 cm左右。在光照培养箱(GXZ-300B，宁波江南仪器厂)培养14天，早晚浇水保持土壤湿润。培养箱温度设定为27.0℃ ± 1.0℃，光照条件为12 h光照12 h黑暗。于第7天统计玉米发芽数，保留长势正常的一株继续培养。第14天测量各株玉米的株高，根茎叶的鲜重和干重。
Table 1. The additions contents of biogas fertilizer (mg)
表1. 各组沼肥的金属添加组成和含量(mg)
2.3. 统计方法
采用Microsoft Excel和SPSS软件进行数据的处理分析，用Origin软件进行图片的绘制，邓肯氏新复极差法(DMRT) (p = 0.05)进行统计 [20]。
3. 结果与分析
3.1. 沼液浸种的影响
如表2所示，对照组CK的发芽势为53.33% ± 5.44%，发芽率为61.67% ± 6.80%，发芽指数为16.06 ± 1.16，活力指数为136.00 ± 9.97。而使用沼液浸种的实验组在这几个参数上均低于对照组，T0组比CK组的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数分别低56.25%、18.92%、49.72%和58.03%。且在发芽势、发芽指数和活力指数上与实验组存在着显著性差异(p < 0.05)，金属污染可能是造成沼液浸种抑制的原因。而额外的金属可一定程度的减少这种抑制现象。其中Ni和Cu的危害性比Zn和Co的较小。T3组的活力指数较T0提高54.16%，与CK组不存在显著性差异；T4组的发芽指数较T0组提高44.23%，高于T1、T2组且与T8、T9组存在显著性差异(p < 0.05)。金属污染抑制种子发芽最严重的为T8和T9组。T8组的发芽势较T0组减少36.67%，与T1~T4组存在显著性差异(p < 0.05)；发芽指数和活力指数分别为减少44.06%和68.70%，与T3、T4组也存在显著性差异(p < 0.05)。仅有T8、T9组在发芽率上与CK组存在显著性差异(p < 0.05)。综上所述，复合金属污染对种子萌发的抑制作用相较于单一金属可能更强烈，危害性也更大。
Table 2. Effects of biogas slurry on germination of maize seeds
表2. 沼液对玉米种子发芽的影响
注：表中数据为平均数 ± 标准误差。同列不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在p < 0.05水平差异显著。
未额外添加金属的T0组的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数较对照组CK分别下降56.26%、18.92%、49.75和58.03。从矿区收获的苜蓿草自身从土壤中吸收了大量金属，经折算在厌氧发酵体系中，Fe的浓度为53.33 mg/L。有实验结果表明在该浓度下，种子的发芽势、发芽率和发芽指数均受到抑制作用 [13]。另一方面，沼液浓度过高也可能是导致T0组发芽率较低的原因之一，史向远等 [21] 的研究显示，当沼液的浓度大于50%时，西瓜种子的发芽即会受到显著的抑制，其在50%浓度的发芽率与本文相类似。当沼液的浓度超过种子所能承受的阈值，细胞膜受到严重的盐胁迫，就会造成种子的缺水，影响种子的生长发育。
如图1所示，用金属污染的沼液浸种对玉米幼苗的生长有一定的抑制作用，对照组CK的芽长和根长分别为3.35 ± 0.21 cm和5.42 ± 0.34 cm。T0组的芽长和根长较CK组分别降低13.13%和28.78%。T5组的芽长的促进作用最大，较T0提高22.07%；T3组对根长的促进作用最大，较T0组提高20.73%。而T8组对玉米芽和根的生长抑制最大，较T0组分别降低28.87%和39.11%；其次为T9组，分别降低18.56%和38.6%。
图2为沼液种类对玉米生物量的影响。从图中可以看出金属污染沼液浸种对玉米幼苗的芽和根的生物量都有抑制作用。对照组CK的芽重和根重分别为0.14 ± 0.01 g和0.10 ± 0.02 g，T0组较CK分别降低20.69%和41.16%。对于芽重，T3~T6组较T0组均有一定促进作用，但是不明显。T2组的的抑制作用最明显，较T0组降低26.34%。在根重上，T3组的促进作用最大，较T0组提升41.45%；T8组的抑制作用最强，降低56.61%。
在本沼液浸种实验中，金属污染的沼液抑制了种子的发芽和生长，但适当的添加额外金属可适当缓解这种抑制作用。王彦杰等 [22] 的研究指出，在高浓度下，谷子种子在24~48 h内的相对电导率下降的程度较小，表明高浓度的沼液抑制谷子种子发芽过程中细胞膜修复过程，且随着浓度增大而增强。通过添加Ni和Cu，一定程度上提高了种子的活力指数。而添加Co则对种子发芽和生物量积累有较大的抑制作用，一方面Co并非是植物生长的必须元素，另一方面，Co盐也增加了沼液的渗透压，增加了对种子的胁迫程度。而Co与部分其他金属的联用并未降低种子发芽率可能是金属共沉淀或其他因素导致的 [23]。在本实验的条件基础上，通过优化沼液浸种浓度以及金属添加量，种子的发芽状况还有进一步的提升空间。
Figure 1. Effects of biogas slurry on the growth of maize seedlings
图1. 沼液对玉米幼苗生长的影响
Figure 2. Effect of biogas slurry type on maize biomass
图2. 沼液种类对玉米生物量的影响
3.2. 沼渣施肥的影响
沼渣肥是一种多元的复合型有机肥，施加沼渣肥能有效降低土壤容重，提高有机质含量和速效养分含量 [24]。如图3所示，施加金属污染的沼肥并未引起发芽率的显著性下降，都维持在90%以上，仅T4和T5组的发芽率为86.67%。
图4则表示了沼渣对玉米幼苗生长的影响。从图中可以看出施加沼肥均促进了玉米幼苗的生长。经过14天的生长周期，玉米幼苗都长出三片叶子，对照组CK的株高为34.09 ± 0.95 cm。T0组的株高比CK组提升8.86%。T4组添加Cu对种子萌发有促进作用，较T0组提升2.60%。其余组均低于T0组为抑制作用。其中T2组的抑制作用最大，较T0组降低7.36%。表明施用含Cu的沼渣肥可促进玉米幼苗的拔高，而施用含有Co的沼渣肥会抑制拔高。
施加沼肥的玉米幼苗的生物量除根的干重均大于对照CK，但未到达显著性水平，各组根的干重没有较大差别(表3)。对照组CK的茎叶鲜重、根鲜重、茎叶干重、根干重分别为1.63 ± 0.15 g、0.66 ± 0.04 g、0.12 ± 0.01 g和0.06 ± 0.00 g，而T0组相较于CK组分别增加了30.84%、8.78%、25.01%和−8.72%。额外的金属污染主要对玉米幼苗的生长起抑制作用，且对茎叶的抑制作用比对根的更强。T2组受到的抑制相对较低，茎叶鲜重和干重相对T0组分别减少6.29%和4.58%，而根的鲜重和干重则分别增加21.21%和7.67%。T3组受到的抑制相对较大，茎叶鲜重和干重相对T0组分别减少25.03%和16.03%。
Figure 3. Effect of biogas residue on germination rate of maize
图3. 沼渣对玉米发芽率的影响
Figure 4. Effects of biogas residue on the growth of maize seedlings
图4. 沼渣对玉米幼苗生长的影响
Table 3. Effects of biogas residue types on maize biomass
表3. 沼渣种类对玉米生物量的影响
注：表中数据为平均数 ± 标准误差。同列不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在p < 0.05水平差异显著。
在本沼渣施肥实验中，施用沼肥的组无论是从株高还是生物量上均要优于对照组，表明沼肥的确可以促进玉米幼苗的生长，这个结果也与其他的研究相一致，且本实验采用的10%的混合比例也是较优的沼渣施用量 [25] [26]。而大部分金属污染则会引起幼苗生长的减缓，表现为株高的降低和生物量的下降。其中Cu金属污染在本实验条件下促进了玉米幼苗的伸长，但在生物量上并未能提升。Cu是众多蛋白质的重要辅因子、参与呼吸代谢和光合作用的电子传递，能调节和改善植物的生理代谢和生长发育，但合适的铜离子含量范围很窄 [9]。因此，虽然Cu污染沼渣虽然在株高上有所增加，但该铜离子浓度还是不适合玉米的生长和增重。其余不管是单一金属污染还是复合金属污染均对幼苗的株高和生物量有抑制作用。由此可知，在农业生产过程中应格外注意重金属污染引起的作物的不良生长。
4. 结论
本研究分析了不同类型金属污染沼肥对玉米种子发芽和幼苗的影响，以种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和和幼苗的芽长、根长、芽重、根重等指标为基础进行了详细的讨论，得到的具体结果为：
1) 金属污染的沼液显著抑制玉米种子的发芽过程，并且对种子的生物量积累也有较明显的抑制作用。复合金属污染对种子萌发的抑制作用相较于单一金属可能更强烈，T8、T9组在发芽势上与T1~T4组存在显著性差异(p < 0.05)，且根和芽的生长和生物量积累都受到较大抑制。部分金属添加也可在一定程度上促进种子的发芽，T3 (Ni)组的活力指数较T0提高54.16%，T4 (Cu)组的发芽指数较T0组提高44.23%。
2) 施用沼渣肥可促进玉米幼苗生长和生物量积累，但大部分金属污染则会造成抑制作用，且对茎叶的抑制作用比对根的更强。T2 (Co)组对株高的抑制作用最大，较T0组降低7.36%。T3 (Ni)组的生物量积累受到的抑制相对较大，茎叶鲜重和干重相对T0组分别减少25.03%和16.03%。仅T4 (Cu)组对株高有促进作用，较T0组提升2.60%。
通过对金属污染沼液沼渣肥的综合分析可得，金属污染对玉米幼苗的生长主要以抑制为主，且多种金属的复合污染对玉米幼苗的危害更强。沼渣肥能促进幼苗的生长，而被金属污染后其促进作用则会受到限制，仅Cu污染的沼渣肥不受影响。有机肥作为一种营养全面、较温和、能改良土壤的肥料，其本身既能有效增加作物产量又对环境破坏较小。而重金属污染一方面影响了作物的生长，另一方面也污染了农田，增加了土地的污染风险等级。本文为有机肥施用过程中各种 重金属的影响提供了数据的支持和理论的依据，今后也应将重金属的影响纳入到有机肥的研究当中。
基金项目
本研究受到国家水体污染控制与治理科技重大专项(2017ZX07101003)资助。
NOTES
*通讯作者。