PD-1抑制剂联用的研究进展

Research Progress of PD-1 Inhibitor Combination

摘要: PD-1抑制剂在癌症治疗领域已获得了巨大的成功，但仍存在很多不足。PD-抑制剂与其他疗法联用是目前临床治疗的发展方向。本文从肿瘤表型分类的角度出发，系统性总结了PD-1抑制剂联用的分类，并介绍了对应的经典疗法。

Abstract: PD-1 inhibitors have achieved great success in the field of cancer treatment, but there are still many shortcomings. Combination of PD-inhibitors with other therapies is the current development direction of clinical treatment. In this paper, we systematically summarize the classification of PD-1 inhibitor combination from the perspective of tumor phenotype classification and introduce the corresponding classical therapies.

1. 引言

2018年，诺贝尔生理学与医学奖被授予给Allison和Honjo，以表彰他们发现了PD-1和CTLA-4这两个免疫检查点。他们研究的证明：免疫系统中存在着一些“刹车”蛋白，作为负性的免疫调节受体，维持机体自身免疫耐受。肿瘤利用这种机制，使得肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中的免疫细胞处于被抑制状态，从而逃脱免疫系统的监视 [1]。

PD-1/PD-L1信号通路可以抑制T细胞的激活、增殖，诱导效应T细胞的凋亡 [2] 从而避免T细胞杀伤肿瘤。同时PD-1/PD-L1信号通路可以抑制调节性T细胞的凋亡维持肿瘤内部免疫抑制的微环境 [3]。

PD-1抑制剂可以恢复T细胞的功能，激活自身免疫系统杀伤肿瘤，所以在不同类型的肿瘤中都有治疗潜力。2020年，帕博利珠单抗获批治疗MSI/MSR (微卫星不稳定性/错配修复)缺陷的癌症，这是首个基于生物标志物分型而非癌症分型的治疗方案。此外，激活后的免疫系统会产生记忆性T细胞，在体内发挥长效的抗肿瘤效果。因此，PD-1抑制剂是一种广谱、长效的抗肿瘤药物。

但PD-1抑制剂也存在很多临床不足：患者对其整体响应率不高(25%左右) [4]、肿瘤容易耐药 [5]、药物的存在副作用 [6] 及肿瘤可能发生超进展(hyperprogressive disease, HPD) [7]。

除了药物疗效问题外，PD-1抑制剂还存在激烈的商业竞争。以帕博利珠单抗为例，最初进入中国时，其年治疗费用超过30万元(包含赠药)。但受国产药降价影响，其两年治疗花费目前已降至14万元(包含赠药)。目前全球已有6款PD-1抑制剂上市。预计2~3年内，全球将会有超过20款PD-1抗体上市，而在研项目超百个。

为提高抗PD-1单抗的疗效、规避激烈的商业竞争，临床开发的方向已从单药治疗转向联合治疗：早在2019年，PD-1/PD-L1联合治疗的临床试验数量已经超过单药治疗的3倍多。本文将系统性介绍抗PD-1单抗联用方案及其机制。

2. 肿瘤的表型及PD-1抑制剂联用的分类

临床上，根据肿瘤中T细胞的浸润和免疫状态不同，我们将肿瘤分为三种表型，分别是：免疫沙漠型(immune deserts)、免疫排斥型(immune-excluded tumors)、炎性肿瘤(inflamed tumors)：

1. 免疫沙漠型肿瘤，其内外都没有T细胞，对PD-1抑制剂几乎无响应。肿瘤通过抑制抗原的释放和呈递，使得T细胞无法被招募。

2. 免疫排斥型肿瘤，其外部存在大量T细胞，但内部很少。肿瘤通过抑制T细胞的浸润，使得被招募的T细胞无法进入肿瘤。

3. 炎性肿瘤，其内部有大量T细胞浸润，对PD-1抑制剂的潜在响应效果最好。但肿瘤可以通过肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中其他途径抑制T细胞的活化、增殖，使T细胞无法杀伤肿瘤；另外当T细胞处于持续的抗原刺激或者长期暴露于慢性炎症环境中时，会发生耗竭现象。此时，T细胞失去正常的免疫应答功能，导致了肿瘤的免疫逃逸。

因此PD-1抑制剂的联用大致可以分为四类：增强肿瘤抗原的释放和呈递、增强T细胞的肿瘤浸润、逆转肿瘤微环境的免疫抑制、增强T细胞的免疫应答。

3. 增强肿瘤抗原的释放和呈递

对于免疫沙漠型肿瘤，联合疗法可以增强肿瘤抗原释放和呈递，提高PD-1抑制剂的响应率。

3.1. 与放化疗联用

放化疗是过去十年与PD-1抑制剂联用中占比最多的类型。局部的放化疗导致肿瘤的免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death, ICD)，同时释放大量的肿瘤抗原。抗原的释放使得肿瘤被免疫系统识别，从而促进T细胞向肿瘤部位迁移和浸润。

此外，放化疗清除了肿瘤中的调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)和骨髓来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)，逆转了肿瘤的免疫抑制，帮助浸润的T细胞杀伤肿瘤。

除放化疗外，一些新技术也可以增强肿瘤抗原的释放与呈递：如肿瘤新抗原疫苗或者溶瘤病毒等。

3.2. 与新技术联用

肿瘤新抗原是肿瘤组织内特异性地表达的抗原，所以具有很好的安全性 [8]。一项使用DC作为疫苗形式的临床试验(NCT00683670)表明，其能有效地招募并激活CD8+ T细胞，同时诱导TCR扩增 [9]。

溶瘤病毒可以特异性地在肿瘤细胞中复制，能够造成肿瘤细胞的ICD，激活机体的获得性免疫系统；同时溶瘤病毒能够引发损伤相关的分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMPs)和病原相关的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，激活机体的固有免疫。OncoMyx公司的一款基于兔痘病毒的溶瘤病毒与PD-1抑制剂联用具有很好的效果 [10]。

3.3. 利用肿瘤自身的呈递机制

肿瘤会通过多种途径下调自身抗原表达，降低自身免疫原性。所以除了使用外源性的放化疗或者疫苗等手段外，我们还可以增强肿瘤自身的抗原呈递机制。ERAP1全称是内质网氨肽酶1。在呈递过程中，胞内抗原首先会被ERAP1分解为小片段，再结合MHC分子。肿瘤会过表达ERAP1，使其自身抗原被过度“修剪”，降低抗原的免疫原性。动物模型结果表明，ERAP1抑制剂与PD-1抑制剂联用优于单药，具有很好的协同效果 [11]。

除了“修剪”抗原，肿瘤也会下调表面MHC分子的表达，帮助自身免疫逃逸。PCSK9是调控血液胆固醇代谢的关键蛋白。但研究人员发现，PCSK9也能直接结合MHC I类分子，介导其在溶酶体中的降解，从而下调肿瘤表面MHC分子的表达。敲除PCSK9的小鼠，肿瘤生长明显减缓；而使用PCSK9抑制剂能上调肿瘤MHC I类分子表达量，从而增强PD-1抑制剂抗肿瘤效果 [12]。

4. 增强T细胞肿瘤浸润

对于免疫排斥型肿瘤来说，PD-1抑制剂疗效不理想主要的原因是T细胞浸润不足。抗原呈递细胞将T细胞从淋巴结募集到肿瘤部位后，肿瘤会限制T细胞的浸润 [13]，主要通过如下三种方法：

首先，肿瘤会下调某些关键趋化因子，从而影响T细胞向肿瘤内部的迁移；

其次，肿瘤会依靠成纤维细胞或者基质细胞形成质密的物理屏障来阻碍T细胞的浸润，这往往伴随着TGF-β的高表达；

最后，异常增生的肿瘤内部血管也会导致高渗、低氧、高间质压的TME的形成，使得T细胞浸润变得困难。

联用疗法也主要从这三个途径增强PD-1抑制剂在免疫排斥型肿瘤中的效果。

4.1. 肿瘤趋化因子

趋化因子可以促进淋巴细胞向特定部位运动，在肿瘤发生和发展过程中具有重要作用。其中，CXCL9、CXCL10和CCL5这三种趋化因子已被证实可以促进T细胞向肿瘤浸润。因而肿瘤会下调这三种趋化因子，避免被T细胞杀伤。使用表观遗传学药物可以增强它们的表达 [14] [15] [16]。将其联用后，具有改善现有PD-1抑制剂效果的潜力。

而CXCL12是T细胞浸润的抑制性的趋化因子。其由成纤维细胞分泌，能将T细胞诱导迁移至肿瘤外。对CXCL12进行抑制可以增强T细胞的浸润状态 [17]，也是一个潜在的靶点。

4.2. 肿瘤的“物理屏障”

免疫排斥型肿瘤往往会形成“坚固”的物理屏障，这同时伴随着转化生因子-β (Transforming growth factor beta, TGF-β)的高表达 [18]。TGF-β对物理屏障的形成至关重要。其会促进成纤维细胞和基质细胞的增殖，帮助肿瘤形成质密的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的形成，同时维持肿瘤的高间质压力。研究证明，TGF-β抑制剂可以破坏肿瘤的物理屏障，帮助T细胞浸润 [19]。临床上，TGF-β抑制剂与PD-1抑制剂联用能使肿瘤应答率显著提升 [20]：在一项针对非错配修复的结肠癌中，联用组取得了33.3%的响应率，而单药几乎无响应(P < 0.05)。

4.3. 肿瘤血管正常化

在VEGF等因子驱动下，肿瘤的血管往往异常增生：形态上曲折膨胀、分布不均；功能上易渗漏，高组织间隙压，同时伴随着局部灌注不足、缺氧等问题。这阻碍了药物的递送和免疫细胞的浸润。Rakesh Jain等提出“血管正常化”(vascular normalization)理论 [21]，即通过低剂量的抗血管生成药物，使肿瘤血管功能和形态上的正常化，改善药物的递送及细胞的浸润。

目前VEGF是与PD-1抑制剂联用最热门的靶点。临床上，Genentech将阿替利珠单抗和贝伐单抗联用，在晚期肝细胞癌治疗中取得良好的协同效果，是肝细胞癌治疗领域的重大突破 [22]。在总体生存期及无进展生存期两项指标上，联用方案均显著优于索拉非尼，同时患者死亡风险降低了42% [22]。在这之前，晚期肝细胞癌的一线治疗药物仅有索拉非尼和仑伐替尼两种。而前者盘踞一线疗法位置已经长达13年。

5. 逆转TME的免疫抑制

肿瘤与其所处的环境构成了一个完整的功能实体。TME是一个由免疫和炎症细胞，肿瘤相关的基质细胞，肿瘤周围的间质、血管、各种代谢产物和因子组成的复杂系统，在在肿瘤的发生、发展、转移过程中发挥了不可替代的作用。TME会通过多种途径抑制浸润的T细胞的功能，帮助肿瘤实现免疫逃逸，促进肿瘤的恶性发展。这里主要介绍TME中的肿瘤代谢产物及免疫抑制细胞两类。

5.1. 肿瘤代谢产物

与正常细胞不同，肿瘤细胞会发生能量代谢的重编程。这不仅可以促进肿瘤的快速生长，还可以竞争性耗竭营养物质从而抑制免疫细胞的生长，帮助肿瘤发生免疫逃逸。

腺苷是TME中一个关键的免疫调节分子：可以抑制正常免疫细胞的分化成熟，发挥免疫抑制作用 [23]。同时腺苷还可以作用于内皮细胞，促进肿瘤血管形成，帮助肿瘤转移。CD39、CD73作为磷酸水解酶先后参与腺苷的产生。将抗CD73抗体与抗PD-1抗体联用，可以降低TME中腺苷浓度，逆转免疫抑制 [24]。腺苷在免疫细胞上的信号受体A2aR和A2bR同样是热门的联用靶点。有研究发现IL-7可以阻断A2aR的信号通路，保护CD8+ T细胞 [25]，同时解除Treg细胞的抑制作用 [26]。

5.2. 抑制性免疫细胞

肿瘤TME中存在大量的免疫抑制细胞，其中比较重要的是肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAM)和调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)两种。

TAM分为M1、M2两类。M2型TAM具有广泛的促肿瘤作用：其高表达PD-L1并分泌免疫抑制性细胞因子；同时M2型TAM还可以促进其他免疫抑制细胞如Treg细胞的增殖、抑制DC的成熟。针对TAM的主要联用思路是通过重编程，将TAM的M2表型逆转为M1表型，例如：靶向CSF-1R靶点可以下调M2相关基因，增强M1表达 [27]；有研究人员发现二甲双胍可以通过AMPK-NF-κB信号通路逆转M2为M1型巨噬细胞，增强PD-1抑制剂效果 [28]。

Treg是目前关注度最高的免疫抑制细胞，可以直接调控T细胞的功能：首先，Treg会耗竭TME中IL-2 (IL-2是T细胞生长因子)，抑制T细胞的活化与增殖；其次Treg高表达CTLA-4，同时会分泌抑制性细胞因子(TGF-β，IL-10和IL-35)，以帮助建立免疫抑制微环境 [29]。最后，Treg细胞可以分泌穿孔素和颗粒酶，直接杀伤APC或者效应T细胞 [30]。

此外Treg也表达PD-1，所以PD-1抑制剂也会解除Treg的受抑制状态 [31]，使其发挥免疫抑制作用。因此当TME中Treg细胞比例过高时，使用PD-1抑制剂并不能激活T细胞。因此特异性清除TME中的Treg细胞，对提高PD-1抑制剂疗效具有重大意义。

上文提到，Treg会竞争性耗竭TME中的IL-2，是因为其高表达CD25。CD25是IL-2受体α亚基。它的存在使得Treg细胞对IL-2的亲和力相较于正常T细胞提高了100倍。罗氏早期研发中心开发出一款CD25非阻断性的抗体，可以结合并通过ADCC效应裂解Treg细胞。同时由于该抗体并不阻断CD25结合IL-2，所以不会对少量表达CD25的正常T细胞产生影响 [32]，可以特异性清除TME中的Treg。

除了CD25，TME中大量存在的乳酸也是特异性清除Treg的一个重要靶点。Treg细胞为了适应肿瘤微环境，会提高对乳酸的代谢 [33]。MCT1是Treg细胞表面的乳酸转运蛋白。Treg细胞通过MCT1蛋白摄入乳酸，获取能量。动物模型中，将MCT1抑制剂与PD-1抑制剂联用后，小鼠肿瘤显著消退，响应率也有提升 [34]。另外研究人员发现CD36可以通过PPAR-β途径调整线粒体，使其适应TME中高浓度的乳酸环境。动物模型中，敲除CD36不会影响动物健康，同时能增强PD-1抑制剂效果 [35]。

6. 增强T细胞的免疫应答

在长期抗原暴露或者炎性反应后，T细胞往往会耗竭或者失能。此时仅仅逆转TME中的免疫抑制已不足以恢复T细胞功能。耗竭性T细胞的特点是表面抑制性受体高表达。通过协同阻断其他抑制性受体、激活共刺激受体或者联用具有免疫调节功能的细胞因子都增强T细胞功能。

6.1. 与免疫检查点抑制剂联用

免疫检查点抑制剂靶点包括：CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT等。

CTLA-4是最常见的免疫检查点联用靶点。虽然CTLA-4也是免疫检查点，但临床上发现抗CTLA-4抗体最主要作用机制是通过结合TME中的Treg细胞并通过Fc介导其清除 [36]，因而可以逆转Treg对T细胞的免疫抑制作用，提高PD-1抑制剂的响应率。目前该联用方案已经获批治疗黑色素瘤、肾细胞癌和结直肠癌 [37]。

LAG-3在TME中多数淋巴细胞上表达，也具有与PD-1联用的潜力，并且可能成为PD-1和CTLA-4后获批上市的第三个免疫检查点。LAG-3可促进Treg分化增殖，并抑制NKT、DC、CD4+ T细胞等的功能。T细胞上的LAG-3与PD-1协同抑制TCR信号 [38]。目前，BMS已经披露了Nivolumab (抗PD-1单抗)和Relatlimab (抗LAG-3单抗)联用的三期临床数据(NCT03704077)：黑色素瘤患者无进展生存期得到明显改善。

TIM-3在PD-1耐药患者肿瘤中高表达。其与PD-1抑制剂联用可以更好促进肿瘤消退 [39]。但TIM-3存在多个配体，因而TIM-3抑制剂的开发难度较大 [40]。

TIGIT可以抑制肿瘤抗原的释放和呈递 [41]。TIGIT与PD-1抑制剂联用后可显著延长小鼠的生存期 [42]。目前，罗氏的替瑞利尤单抗(抗TIGIT抗体)和阿特珠单抗(抗PD-L1抗体) 联用方案已经被FDA授予突破性疗法，用于治疗一线转移性非小细胞肺癌。一项三期临床也处于开展中(NCT04294810)。

6.2. 与免疫检查点激动剂联用

大量临床前研究表明，免疫检查点激动剂(4-1BB, OX40, ICOS, CD27, GITR)可以促进T细胞激活、增殖。但其单用的临床效果不佳：往往具有很强的毒性，同时响应率较低 [43]，目前尚未有免疫检查点激动剂获批上市。所以将免疫检查点激动剂与PD-1抑制剂联用是热门的临床推进方向。其中比较重要的联用靶点是4-1BB与OX40。

4-1BB (CD137)是TNF受体超家族的成员。T细胞激活后，4-1BB上调表达，并通过NF-κB和MAPK通路，延长T细胞的存活。但4-1BB激动剂单独给药效果并不佳，同时具有较大的毒性 [44]。而与PD-1抑制剂的联用则显示出很好的协同作用：可以逆转CD8+ T耗竭，增强自体的肿瘤免疫 [45]。

OX40是T细胞的共刺激因子，作用与4-1BB类似。此外OX40的共刺激可以抑制Treg的FOXP3基因，抑制Treg细胞的分化。动物模型中，OX40激动剂与抗PD-1抗体联用取得了很好的联用收益，可以逆转T细胞的耗竭 [46]。

6.3. 与细胞因子联用

除了免疫检查点外，TME中的细胞因子也是一种很重要的免疫调节靶点。白介素(IL-2、15、21)、生长因子(GM-CSF)、干扰素(IFN-α)和肿瘤坏死因子(TNF-α)都具有与PD-1抑制剂联用的潜力 [47]。此外，中和一些免疫抑制因子(IL-6、IL-10)也能增强PD-1抑制剂的临床疗效。

IL-2是首个被用于临床治疗的肿瘤免疫药物，对T细胞的发育和扩增具有重要作用。但其治疗窗口窄、半衰期短。同时IL-2对Treg细胞有更高的亲和力，所以低剂量时会优先激活Treg，导致免疫抑制。而高剂量又具有很高的毒性，会引发致命性的血管渗漏 [48]。有研究表明，IL-2与PD-1抑制剂联用使得小鼠肿瘤完全消退。临床研究也表明，IL-2和PD-1抑制剂联用可以提高响应率 [49]。

IL-15和IL-21都具有与IL-2类似的效果。其中IL-15与PD-1抑制剂联用后患者生存率上升 [50]。IL-21在动物模型中具有更好的抗肿瘤效果，但缺少临床数据支撑 [51]。

7. PD-1抑制剂的展望

除肿瘤治疗外，PD-1抑制剂也被应用于其他疾病的治疗，如HIV和阿尔兹海默症：HIV病毒会上调T细胞表面的PD-1，导致其耗竭。将PD-1抑制剂和TIGIT抑制剂联用，可以逆转这种耗竭，增强免疫反应，促进HIV的清除 [52]。在针对阿尔兹海默症的研究中，研究人员发现PD-1抑制剂可以募集巨噬细胞进入大脑，清除组织中的淀粉样β斑块，改善小鼠的认知反应 [53]。这提示我们，PD-1靶点在肿瘤治疗之外，仍然具有巨大的应用潜力。

同时，随着临床治疗和研究的深入，我们对于PD-1的机制取得了更深入的认识。有研究表明，当肿瘤抗原的释放和呈递不足时，PD-1抑制剂的使用不但不能激活杀伤性T细胞，反而使其功能紊乱，杀死T细胞 [54]；还有学者发现PD-1在肿瘤细胞上也广泛表达，且可以通过AKT和ERK1/2等信号通路抑制肿瘤生长。使用PD-1抑制剂后，解除了PD-1对肿瘤的抑制。若此时T细胞募集和活化水平较低，PD-1抑制剂反而可能导致肿瘤的超进展 [55]。这提示我们PD-1抑制剂具有两重性。

联用疗法可以解决PD-1抑制剂在临床上遇到的很多不足，但往往也会增强毒副作用 [56]。PD-1与CTLA-4的抑制剂联用后，患者的副作用发生率明显上升 [57]；PD-1抑制剂与EGFR或者ALK抑制剂联用不仅效果不理想 [58]，还可能出现严重副作用，导致患者死亡 [59]。所以如何降低联用疗法的副作用，是目前研究的一个重点。有研究就是在PD-1、CTLA-4联用基础上，对TNF-α进行阻断，发现可以改善动物模型中炎症副作用，同时增强抗肿瘤效果 [60]。

8. 结语

PD-1抑制剂是肿瘤治疗领域的重大突破，已经获得了巨大的临床收益和商业成功，但也面临着商业竞争加剧及临床疗效不足两方面问题。这驱使着工业界和学术界通过联合疗法寻求突破。本文从肿瘤的不同表型出发，总结出PD-1联用的四种机制，并介绍了具有代表性的联用疗法。我们相信随着研究的深入，PD-1抑制剂会为更多的肿瘤患者带来帮助。

NOTES

^*通讯作者。