摘要: 稻李氏禾已成为东北稻区新的问题杂草。本文为揭示东北部分稻区稻李氏禾的迁入来源及内部扩散途径，利用ISSR分子标记技术和形态特征差异对来自江西南昌县、湖北荆州、黑龙江、吉林和延边稻区的24份稻李氏禾种质资源进行了遗传多样性和形态差异分析。试验用12条引物进行扩增，共扩增出122个ISSR条带，其中多态性条带113个，多态性百分率为92.62%，平均每条引物扩增出10.2个条带。遗传相似系数为0.3114~1.0000，说明不同稻李氏禾间存在较大差异。在遗传相似系数为0.90时，可分为三大类，既吉黑两省东部稻区稻李氏禾归一大类，南方稻区江西南昌县和湖北荆州各一类。在形态特征差异上，南方稻区采样的稻李氏禾与东北稻区稻李氏禾之间表现出极大差异性，两者属于不同生态型；而东北稻区内部不同地点采集的稻李氏禾之间表现出极大相似性，是属于相同生态型。
Abstract:
Leersia oryzoides (L.) Sw has become a new problem weed in northeast rice area. This paper aims to reveal the intrusion source and internal diffusion of Leersia oryzoides (L.) in parts of northeast rice area. The genetic diversity and morphological differences of 24 Leersia oryzoides (L.) Germplasm from Nanchang County in Jiangxi, Jingzhou in Hubei, Heilongjiang, Jilin and Yanbian were analyzed by ISSR molecular marker technique and morphological differences. 12 primers were selected, a total of 122 bands were amplified, including 113 polymorphic bands, the percentage of polymorphism was 92.62%, and an average of 10.2 bands were amplified for each primer. The genetic similarity coefficient is 0.3114~1.0000, which indicates that there is a big difference between different Leersia oryzoides (L.) varieties. When the genetic similarity coefficient is 0.90, it can be divided into three categories: Leersia oryzoides (L.) belonging to the same category in east rice area of Jilin province and Heilongjiang province, Leersia oryzoides (L.) from Nanchang County in Jiangxi and Jingzhou in Hubei belonging to the other two categories respectively. In terms of morphological characteristics, there was a great difference between the Leersia oryzoides (L.) sampling in southern paddy and the rice sampling in northeastern paddy. They belong to different ecotypes, but the Leersia oryzoides (L.) showed great similarity sampling in different places in the northeast paddy; it’s the same ecotype.
1. 引言
稻李氏禾[Leersia oryzoides (L.) Sw]为多年生禾本科假稻属水生或湿生杂草 [1] [2] [3]。稻李氏禾具有地下横走根茎和地上匍匐茎 [4]，繁殖力很强 [5] [6]，种子和根茎都可繁殖 [7]。稻李氏禾幼苗形态与水稻相似，叶片边缘和茎秆生有钩状刺 [8]。稻李氏禾幼苗拔节后生长迅速，很快超过水稻株高，危害严重，除了与水稻争夺养分以外，更重要的是稻李氏禾在植株高于水稻后会由于茎基部纤细而倒伏，在稻李氏禾密度达到50~80株/m2以上时，可使未成熟水稻倒伏而造成严重减产，同时增加阻力严重影响联合收割机的作业效率产。稻李氏禾有根系发达、生命力强、繁殖快等特点 [1]、扩散多途径特点、与栽培稻相似伴生特点，造成了防除稻李氏禾投入成本高、防治难、草害重的问题 [9]。
在稻李氏禾资源的利用上，杨长桃等采用幼胚培养和延续授粉法克服属间杂交不可交配性，首次获得水稻 × 李氏禾属间远缘杂交的成功(1985~1989年)，并在杂交后代中获得一些有利用价值的特殊材料 [10]。国外也有利用稻李氏禾资源减少水渠、湖泊生态系统的养分输出、氮素污染等研究进展报道 [11] [12] [13]。
目前，还没发现ISSR技术应用于稻李氏禾遗传资源多样性的相关研究报道。宋志平等人利用 ISSR标记技术对中国湖南地区及其他地区来源的李氏禾进行了遗传多样性分析 [14]。本文通过ISSR分子标记技术和形态特征差异分析，为揭示延边稻区乃至东北稻区各地发生的稻李氏禾的发生源、迁入源、扩散途径，安全有效、综合持续防控稻李氏禾提供重要基础依据。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
供试的24份稻李氏禾样本采集于吉林省中、东部稻区、黑龙江东北部稻区、江西、湖北等不同地区。2020年8月收集后，移栽在农学院玻璃温室水池中，温室有自动控温系统，夏季温度保持在20℃~35℃，冬季温度保持在10℃~25℃。材料来源及采集地见表1。
2.2. 总DNA的提取及检测
取新鲜的稻李氏禾叶片约1 g在液氮冷冻下研磨成粉末，利用天根公司Plant Genomic DNA Kit (DP305-02)试剂盒提取基因组DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其质量和浓度后，用TE缓冲液稀释提取的DNA至20 ng/μL，放入−20℃冰箱储存备用。
2.3. 引物筛选及PCR扩增
采用宋志平等人对李氏禾issr分析中所用的12条引物(2005)，由深圳华大基因科技服务有限公司合成。引物退火温度(表2)。经过优化和比较，确定ISSR扩增反应体系为(20 μL)：ddH2O 6 μL，ISSR引物1.5 μL，DNA模板2.5 μL，GoTaq® Green Master Mix 10 μL (由美国普洛麦洛公司合成，含有Taq-DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液)。PCR反应程序为94℃预变性4 min；94℃变性45 s，复性退火温度随引物而定45 s，72℃延伸45 s，40个循环；最后72℃延伸7 min，4℃下保存。
Table 2. Twelve tested ISSR primers
表2. 12条供试ISSR引物
2.4. 数据处理及分析方法
将实验中所做出来的琼脂糖凝胶胶板拍照，对胶板中的电泳条数进行判读。按照电泳图谱中同一位置上DNA条带的有无进行统计，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，以较为清晰的记为1不清晰的记为0，模糊条带记为0的原则，在EXCEL中记录成0/1矩阵形式。用NTSYS2.10对ISSR分子标记统计好的01矩阵数据做UPGMA聚类分析。
3. 结果与分析
3.1. 引物扩增结果分析
12个扩增条带清晰、多态性高、重复性好的ISSR引物对24份稻李氏禾种质资源进行ISSR分析，结果(表3)表明，每条引物扩增产生的条带数在8~14条，平均为10.2条，12条引物扩增共获得条带122条，其中多态性条带为113条，引物平均多态性比率达92.62%，ISSR扩增结果表明稻李氏禾种质资源具有较为丰富的遗传多样性。图1为部分引物对供试样品的扩增结果。
Table 3. Amplified results of 12 effective ISSR primers
表3. 12条有效ISSR引物的扩增结果
Figure 1. The electrophoresis of amplification products of primer 890
图1. 引物890扩增产物的电泳结果
3.2. 稻李氏禾种质资源间遗传相似性分析
利用12条ISSR引物产生的标记信息，经NTSYS2.10计算24份稻李氏禾种质资源的遗传相似系数，24份稻李氏禾种质资源的遗传相似系数为0.3114~1.0000。其中，遗传相似系数最小的是2 (江西省南昌县)和17 (龙井市智新镇龙池村)，2 (江西省南昌县)和21 (密山市兴凯湖农场)，说明二者的亲缘关系最远，遗传差异相对较大；遗传相似系数最大的为3 (延吉市朝阳川镇太兴村)和4 (延吉市朝阳川镇九水河)，6 (和龙市头道镇振兴村)和7 (和龙市头道镇新进村)说明二者的亲缘关系最近。在遗传相似系数等于0.90时，可分为三大类，既吉黑两省东部稻区稻李氏禾归一大类，南方稻区江西南昌县和湖北荆州各一类(图2)。由于南方稻区样本数很少，在ISSR分析中，江西、湖北稻区取样的稻李氏禾DNA差异性大。
Figure 2. Cluster analysis of ISSR molecular markers in 24 Leersia oryzoides (L.) Sw
图2. 不同稻区稻李氏禾样本ISSR分子标记聚类分析
3.3. 不同地方采集的稻李氏禾种质资源形态特征
吉黑两省稻区稻李氏禾根茎繁殖个体出土期为5月中旬，种子出土期为6月上旬，相差20天左右。茎节(叶片)数为8~10个，株高120~200 cm，平均发生3~7个分蘖，地上茎可横向匍匐生长，出2~3叶开始拔茎，叶茎上有朝下方向的硬刺，易损伤皮肤，接触地表的茎节可生根张出新芽，地下有多条横向伸长的地下根茎，根茎节上产生很多营养繁殖的新根新芽，成为独立的个体。抽穗开花期根茎个体为8月上旬，种子个体为8月中旬，成熟期为抽穗后15~20天左右，边成熟边开始落粒。一穗粒数大约100~300个，结实率为40%~60%左右，千粒重为1.9~2 g。值得进一步研究的是高纬度的黑龙江省鸡西、虎林、佳木斯、依兰等稻区发生的稻李氏禾的抽穗期比低纬度的吉林省东部稻区早10天左右，而江西、湖北地区采集的稻李氏禾在延边地区温室条件下到了11月末还没出穗(5月当地取根茎，5天后温室移栽)。另外。南方稻区采集的稻李氏禾与东北稻区采集的稻李氏禾相比，具有南方稻区采集的稻李氏禾总的出叶片数多2~4片、叶片短而窄型，茎节数多，株高高的特点。
4. 讨论与结论
1983年在黑龙江省桦南县水田首次发现稻李氏禾以来，东北三省各主要稻区陆续发现稻李氏禾的发生 [9] [15]，并继续扩散，成为东北稻区新的问题杂草种之一 [16]，亟待于研发安全有效、综合持续控防稻李氏禾的防除技术体系。
南方稻区采集的稻李氏禾与东北稻区采集的稻李氏禾相比，除具有地下横走根茎和地上匍匐茎、种子和根茎繁殖、叶片边缘和茎秆生有朝下钩状刺等同种共性特征以外，还具有生育期、叶片数及茎节数、叶片形态等不同的特征。ISSR分子标记分类结果也证明南方稻区采集的稻李氏禾与东北稻区采集的稻李氏禾之间的亲缘关系甚远。针对东北稻区稻李氏禾的起源、迁入源，在稻李氏禾分布普查中吉林省桦甸市腰甸子村村民(李军，1961年出生、张学清，1956年出生、陈文安，1954年出生)证实在82年实施联产承包责任制之前本地稻田就有稻李氏禾(该农田是1935年日本军方开拓团开垦的供粮基地之一)，并该地区稻田一直发生稻李氏禾。
综合上述，本文认为东北稻区生长的稻李氏禾在短时间尺度上(20年左右)并不是南方稻区迁入的，既江西南昌、湖南荆州采集的稻李氏禾不是东北稻区稻李氏禾的迁入源，而对于南方稻区是否存在与东北稻区稻李氏禾同类种植资源和长时间尺度上(50年以上)南方稻区稻李氏禾迁入东北稻区后发生适应性突变等相关问题，则有待于进一步验证；东北稻区稻李氏禾相似性极高，认为是存在同一或相近的东北地区起源地；近期东北稻区稻李氏禾的快速扩散和大发生与跨地区稻种流通多、跨区域收割机作业多等因素相关。
基金项目
国家自然科学基金(编号：31760521)。
NOTES
*通讯作者。