一氧化碳释放材料的研究进展

Progress in Research of Carbon Monoxide Releasing Materials

摘要: 一氧化碳(Carbon monoxide, CO)是一种具有重要生理功能的内源性气体信号分子，在治疗多种疾病方面显示出较大的应用前景，然而CO的固载和体内释放方式不理想限制了其临床应用。设计和制备具有靶向控释的一氧化碳释放材料成为了该方向的研究热点。本文综述了近年来报道的CO释放材料的种类、释放触发机制及释放检测等，并比较了其生物相容性、CO释放时长等方面的性能，展望了未来CO释放型材料的发展趋势。

Abstract: Carbon monoxide (CO) was an endogenous gas signaling molecule with important physiological functions and had shown great potential in the treatment of various diseases. However, the clinical applications were limited by the unsatisfactory way of CO sequestration and in vivo releasing. The design and preparation of CO release materials with targeted controlled release had become a top research priority in this direction. In this paper, we reviewed the types of CO-releasing materials, release trigger mechanisms and release detection reported in recent years. We compared their performance in terms of biocompatibility, CO release duration, etc., and looked forward to the future development trend of CO-releasing materials.

1. 引言

一氧化碳(CO)是继一氧化氮之后被发现的另一种人体内必不可少的内源性信号传导分子。CO在机体内由血红素加氧酶催化血红素而产生，通过信号传导和其他调节方式参与了机体的多种病理生理过程，具有扩张血管、抗增殖、抗凋亡和抗炎作用。作为一种重要的治疗性气体信号分子，CO具有较大的临床应用潜力，然而CO的输送方式不理想一直是限制其临床应用的技术难点。由于CO与血红蛋白(Hb)的亲和力比O₂与Hb的亲和力大200~300倍，形成结合牢固的COHb，因此通过气体吸入方式输送CO，当形成的COHb占人体总Hb的10%及以上时，就会造成头晕乏力等CO中毒症状 [1]。为了克服直接吸入CO面临的问题，研究人员制备了一氧化碳释放分子(CORMs)作为一种CO的给药途径。CORMs的出现提高了CO应用的效率和安全性，极大地推进了CO的生物学功能及应用研究，但其生物相容性、靶向性及持续作用时间等仍有待提高。另一方面，大分子与纳米材料因其优异的性能而备受科研工作者关注，将CO或CORMs与大分子或纳米材料集成为一体成为了热门研究，该复合材料提高了CO的释放时长，在一定程度上解决了药用CO的精确输送和可控释放等难题，有可能实现CO的临床使用。本文对近年来报道的CO释放材料进行了综述，并主要集中在多功能CO释放大分子或纳米材料方面的最新进展，并对CO释放材料今后的发展进行了展望。

2. 一氧化碳释放材料

2.1. 一氧化碳释放分子

一氧化碳释放分子(Carbon monoxide releasing molecules, CORMs)是一类含羰基的化合物。CORMs可由不同的化学成分组成，分为含金属核心的CORMs和有机CORMs两类。2002年首次报道含金属核心CORMs后，各种CORMs陆续被合成和用于研究，近些年出现的有机CORMs在CO释放机制、释放时长和生物相容性等方面，与含金属核心的CORMs均存在较大的差异。

2.1.1. 含金属核心的CORMs

早期研究的CO释放材料均是含金属核心的CORMs，尤其是以过渡金属为核心的羰基配合物居多。2002年，Motterlini等人 [2] 设计合成了CORM-1和CORM-2 (结构式如表1)。其中，CORM-1为二锰十羰基(分子式Mn₂(CO)₁₀)，其只能通过光催化的方式释放CO，释放时长在40 min左右；CORM-2为三羰基二氯代钌二聚体(分子式[RuCl₂(CO)₃]₂)，需要在二甲基亚砜的溶液中才能释放CO，且几分钟之内就会释放完全。CORM-1和CORM-2作为CO释放材料改变了CO的给药方式，从气体吸入方式转变为固体装载方式，提高了CO的给药效率和安全性。由于CORM-1和CORM-2不能在生理条件下自发释放CO，且CO释放时长过短，存在明显的应用的局限性。2003年，有研究团队 [3] 报道了在生理条件下即可自动释放CO的CORMs，三羰基氯(甘氨酸)钌(II) (分子式Ru(CO)₃Cl(glycinate)，CORM-3)，结构式如表1所示。该材料在生理条件下即可快速释放CO，实验结果表明其可保护心肌细胞和组织免受缺血再灌注损伤。后续研究的含金属核心CORMs绝大多数均可在生理介质中通过配体转移反应释放CO，无需有机溶剂或外界条件的刺激。值得注意的是，含金属核心CORMs都是以重金属如锰、钌等作为配位中心，以羰基为配体得到的羰基金属配合物，当CORMs释放CO后，重金属离子的残留往往会产生细胞毒性，可能会导致严重的细胞损伤 [4]。Winburn等人 [5] 对CO充分释放后的CORM-2进行细胞学实验，发现其残留物具有较强的细胞毒性，导致细胞的凋亡和坏死增加，线粒体酶活性受到抑制。

Table 1. Structuralformulaeofthree carbon monoxide release molecules containing heavy metalcores

表1. 三种含重金属核心的CORMs结构式

2.1.2. 有机CORMs

由于含金属核心CORMs不可避免的生物毒性，研究者们设计合成了有机CORMs。有机CORMs以各种含C=O双键的有机物作为CO供体，如草酸、硼羧酸盐、醛、不饱和环α-二酮、硅羧酸盐以及氧杂蒽羧酸盐 [6]，由于化学键的稳定性较高，大多数有机CORMs需要在外界条件的刺激下才能引发CO的释放 [7]。首个有机CORMs是一种水溶性硼酸钠盐(分子式Na₂[H₃BCO₂]，CORM-A1)，它在水溶液中即可释放CO [8]。与上述金属核心CORMs相比，它不含重金属配位中心，且CO的释放延长，在生理环境下的释放半衰期约为21 min。此后，非金属核心CORMs被大量开发设计，其研究的侧重点在于提高靶向性和实现在生理环境下的自动释放。如使用具有靶向功能的基团将有机CORMs包裹起来形成较大的“药物球”，该“药物球”到达定点部位后能够被原位打开(如被特异性酶剪切、与较高浓度H₂O₂反应)而将CORMs释放出来 [9]。此外，基于共轭双烯与炔烃基团的Diels Alder反应，Wang等人 [10] 通过甘露糖修饰的四苯基环戊二烯酮(TPCPD)和双环-[6,1,0]壬炔(BCN)构建有机CORMs，当两种物质在生理环境中相遇时发生Diels Alder反应而释放出CO，研究者将其命名为“点击释放”，如图1所示。

2.2. 复合型一氧化碳释放材料

CORMs临床应用的主要障碍之一是CO的靶向可控释放难以实现，而大分子或纳米材料由于其独特的性能，如高载药量、生物相容性好、稳定性好以及可通过被动(如EPR效应)或主动靶向效应给药而备受关注。通过将CO或CORMs与大分子或纳米材料集成在一起，在一定程度上实现了CO的靶向可控释放。

2.2.1. 大分子复合CO释放材料

近年来有些研究者将能释放CO的单元嵌入到天然大分子和合成高分子中，设计出了新型的CO释放材料。如Brückmann等人 [11] 将羰基锰接枝到甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)的共聚主干上，该复合物可在光催化下释放CO，释放半衰期在20 min左右，其基于癌症部位的EPR效应可被动蓄积和靶向药物输送，释放CO后共聚物发生降解，由肾脏清除；Govender等人 [12] 合成了含有羰基锰片段的聚吡啶树枝状大分子，其稳定性高，CO负载量大，该复合材料在光催化下释放CO，释放时长在1 h左右。这类含羰基锰片段的高分子材料与CORM-1类似，需要在光的引发下才能有效释放CO。

Figure 1. A “click and release” of CO based on Diels Alder reaction [10]

图1. 基于Diels Alder反应的CO“点击释放” [10]

蛋白质作为天然大分子材料，具有良好的生物相容性，用其制备蛋白-CORMs复合物引起了研究者的关注。2007年，Razavet及其研究团队 [13] 成功合成了第一个蛋白质–羰基锰复合物，其研究结果显示多肽链空间上的保护作用提高了蛋白–羰基锰复合物的稳定性，这为后续蛋白-CORMs复合物的研究奠定了基础。随后，含有组氨酸的复合物ALF186 (分子式fac-[Mo(CO)₃(histidinate)]Na)被设计合成 [14]，该复合物在体外生理条件下可释放出2.6当量的CO，释放时长约为4 h；如图2所示，Tabe等人 [15] 利用HEWL (蛋清溶菌酶)修饰CORM-2，将CO释放时长提高到几十分钟(CORM-2的释放时长仅有几分钟)；Maruyama等人 [16] 合成了一种结合CO的血红蛋白囊泡(CO-HBV)，用于肺纤维化小鼠的治疗取得了良好的疗效。总的来说，蛋白质复合CO释放单元在一定程度上改善了CORMs的性能，但由于蛋白质本身存在的一些问题，如免疫原性、体内酶催化降解等，也限制了其实际应用。

2.2.2. 金属有机框架复合CO释放材料

金属有机框架(Metal-Organic Frameworks, MOFs)材料是一类以金属离子为节点，有机配体为桥连，通过配位作用或分子间作用力自组装形成的有机–无机杂化材料，由于其孔隙率高，比表面积大及结构多样性等优点 [17]，作为药物载体以及气体吸附材料显示出了巨大的应用潜力。Barea等人 [18] 合成了具有球形、棒状和针状形貌的Al-MOFs并通过固液浸渍法负载CORMs，其研究结果表明载药后球形MOFs材料略有降解，而棒状和针状MOFs材料能保持其结构的完整性；同时，在光照的刺激下，棒状MOFs材料的CO释放效率要高于针状。另有研究表明 [19]，MOFs晶体颗粒的粒径越小，其对于CO供体的负载效率和CO释放效率越高。基于MOFs材料的高负载量，结合高浓度CO (>100 ppm)对癌细胞的杀伤作用 [20]，Shen等人 [21] 采用Fe-MOFs负载MnBr(CO)₅和抗癌药物阿霉素(DOX)，在近红外照射下3 min左右即可通过光热效应释放药物，CO和DOX的联合释放表现出了良好的肿瘤抑制效果，同时CO的释放可减少DOX对正常细胞的损害；Yeh等人 [22] 利用MOFs材料装载CORMs也在抑制肿瘤生长实验中取得了良好的效果。受到人体内CO与血红蛋白中Fe(II)离子高亲和力的启发，Ma等人 [23] 研究通过含Fe的MOFs直接装载CO气体。他们采用微波辅助合成法制备了MIL-88B-Fe和NH₂-MIL-88B-Fe材料(结构如图3所示)，并通过高温真空活化得到具有Fe(II)不饱和位点(最高为铁总含量的29.8%)的材料，将其放置在CO气氛下12 h成功固载CO气体，其装载量分别为0.36和0.69 μmol CO/mg MOFs，CO释放半衰期分别为38 min和76 min，这也是MOFs材料直接装载释放CO的首次报道。

(a) (b)

Figure 2. Schematic representation of the preparation of CORM2-HEWL (a) and CO release in the vicinity of cells (b) [15]

图2. CORM2-HEWL的制备(a)及其在细胞附近CO的释放(b)示意图 [15]

Figure 3. Structure of MIL-88B-Fe [23]

图3. MIL-88B-Fe的结构 [23]

2.2.3. 纳米粒子复合CO释放材料

纳米胶束通过亲疏水端基“包裹”CORMs可提高CO的负载量、防止CO突释及提高靶向性。Hubbell等人 [24] 制备了一种能释放CO的胶束，由CORM-3作为CO供体链段，亲水性聚乙二醇嵌段和疏水性丁基丙烯酰胺嵌段作为“外壳”形成了球形纳米胶束。研究结果表明该胶束具有很高的CO负载能力，且在PBS溶液和血清中保持稳定，并在半胱氨酸等含硫化合物的作用下释放CO，释放时长相比与CORM-3有较大的提高。同时，该CO释放胶束具有良好的生物活性和生物学功能，可有效减弱脂多糖诱导的人单核细胞NF-κB活化(如图4所示)。另外，Maeda等人 [25] 也成功制备了以CORM-2作为CO供体链段的复合胶束，较CORM-2提高了CO的释放时长，并具有更长的抗菌活性，可显著改善小鼠结肠炎症状。

Figure 4. Schematic illustration of CORM-3 nanomicelles formation and CO release after cellular uptake [24]

图4. CORM-3纳米胶束的形成和细胞摄取后CO释放的示意图 [24]

纳米自组装肽具有良好的生物相容性，且其结构具有高度的可设计性，用作CO释放复合材料可减少生物毒性，提高装载稳定性，延长CO释放的时间，实现CO的靶向释放。Stupp等人 [26] 用三羰基钌与两亲性多肽共价结合合成了一种自组装多肽，该多肽可自组装形成纳米纤维水凝胶。该水凝胶能自发释放CO，且具有相对较长的释放时间(与自发释放CO的CORMs相比，如CORM-3，该复合材料的CO释放时长在CORM-3的8倍以上)。实验表明该多肽复合CO释放水凝胶在氧化应激条件下能发挥细胞保护作用，提高心肌细胞的存活率。Schatzschneider等人 [27] 利用转化生长因子(TGF-β)的多肽合成了一种CORMs-肽结合物，该复合物可通过互补序列的识别来靶向输送CO，为CO定向输送到组织和细胞提供了一种新的思路。

其他纳米粒子如脂质纳米粒子、硅基纳米粒子、聚合物纳米粒子等材料由于其纳米物质的特性，可提高CO释放材料的稳定性、CO释放时长，在一定程度上实现CO的定点输送及精确释放。Kim等人 [28] 通过热高压均质法制备了CORM-2脂质纳米粒子，提高了CO的释放时长(约为CORM-2的10倍)，增强了CO的抗炎作用。Barea等人 [29] 采用硅基纳米粒子装载CORMs，大大提高了CO的释放时长，24 h后该复合物仍有少量的CO释放，且多孔性硅基纳米粒子对CO释放后的锰金属残留物具备良好的截留能力(72 h检测截留率为86%)，可减少对正常细胞的损伤；Dordelmann等人 [30] 将光催化CORMs与二氧化硅纳米粒子共价相连，并在光引发下实现了CO在肿瘤组织的定点控释。Boyer等人 [31] 通过CORM-2与含聚(4-乙烯基吡啶)共聚物的偶联反应，制备了释放CO的聚合物纳米粒子。与CORM-2相比，其CO释放量、释放时长均有较大提高。

综上，将大分子或纳米材料与CO或CORMs集成制备CO释放材料，提高了材料的稳定性和CO的释放时长；同时，通过大分子或纳米材料特定的靶向设计实现了CO的定点释放，为CO的精确治疗开辟了新的途径。另外通过大分子或纳米材料的涂覆或包裹，还在一定程度上减少了CORMs的毒性，提高其生物相容性。

3. 一氧化碳释放的检测

由于CO的释放量及释放时长决定了CO释放材料的功能和疗效，因此需要对材料的CO释放行为进行检测和活体内监测。传统的CO检测方法有电化学法、气相色谱法、吸收光谱法等 [32]，这些方法在检测CO释放时均面临着灵敏度低、无法原位监测、无法用于细胞或活体检测等问题，存在较大的限制。

3.1. 肌红蛋白法检测CO释放

目前，实验室应用最多的CO释放检测法是肌红蛋白法 [33]，该方法先将肌红蛋白(Mb)还原为脱氧肌红蛋白(Deoxy-Mb)，然后CO与脱氧肌红蛋白反应生成碳氧血红蛋白(Mb-CO)，通过分光光度计来反映其转化过程，其过程由557 nm左右处的单峰转换为540 nm和577 nm左右处的双峰，如图5所示。该方法灵敏度尚可，是定量CO释放材料释放CO的量与速率的常见方法。然而，该方法在还原肌红蛋白时需加入过量的连二亚硫酸钠，该物质会加速CO的释放，影响测试结果 [34]；另外，溶解度差的CO释放材料还会造成溶液浑浊，存在较大的测量误差 [35]；此外，该方法也不适用于细胞或活体的CO原位监测。

Figure 5. UV-vis spectra of the deoxy-Mb and Mb-CO [33]

图5. 脱氧肌红蛋白和碳氧肌红蛋白的UV-vis光谱 [33]

3.2. 特异性荧光探针检测CO释放

随着荧光技术的发展，荧光探针由于其出色的灵敏度、极低的检测下限及选择特异性、生物相容性好等优点越来越得到科研工作者的青睐，并且还可实现细胞及活体的原位实时监测，在生物医学研究领域显示出较大的优势 [36]。钯是一种与CO具有强亲和力的重金属元素，同时其通过重原子效应还能淬灭荧光。基于此，绝大多数CO荧光探针为钯离子与荧光剂的配位化合物。当环境中出现CO时，钯离子与荧光剂的配位键被破坏，淬灭的荧光再次释放荧光信号。2012年，Chang等人 [37] 报道了一种新型的基于钯介导的羰基化荧光探针COP-1，能够高选择性地检测生理环境和活细胞中的CO，为生物体系中CO的检测提供了一种较好的方法；2017年，Lin等人 [38] 提出了一种用于内源性CO监测的双光子激发近红外荧光探针1-Ac，该探针采用醋酸钯和尼罗红合成，稳定性好，背景荧光小，检测下限低，在CO存在时显示出最大60倍的荧光增强，是一种较为理想的检测CO释放的荧光探针，并且作者还利用此探针首次追踪了活体斑马鱼胚胎和小鼠器官中的内源性CO，如图6所示。

(a) (b)

Figure 6. Fluorescence images of endogenous CO using probe 1-Ac in zebrafishembryos (a) and mouse organs (b) [38]

图6. 探针1-Ac用于活体斑马鱼胚胎(a)和小鼠器官(b)内源性CO的荧光成像 [38]

近年来，有研究者将荧光探针技术与CO释放材料结合起来，实现了CO释放的实时原位监测。Zhou等人 [39] 设计开发了一种荧光探针CO释放型材料CORM3-NIR，可有效监测活细胞与活体中CORM-3释放的CO，如图7所示。该材料以荧光剂Qcy-7为基础，使用4-硝基苄基来固定CORM-3，在生理环境下即可释放CO，细胞与活体小鼠实验显示出良好的近红外荧光生物成像能力。这种结合荧光技术的CO释放型材料对于CO释放的实时监测可以用于指导按需给药。

Figure 7. CORM3-NIR for real-time monitoring of CO release from CORM-3 [39]

图7. CORM3-NIR用于CORM-3释放CO的实时监测 [39]

4. 总结与展望

CO的生物学功能有望用于治疗多种疾病，近年来如何将CO固载并用于治疗越来越引起人们的兴趣和关注。各种固载CO的材料先后被开发和用于研究，CORMs的出现首先使CO被固载下来并用于其生物学功能的探索，但存在靶向性差、CO释放时长较短、重金属离子的潜在毒性等问题；采用大分子或纳米材料与CO或CORMs集成的复合材料，提高了CO输送的稳定性和释放时长，在一定程度上实现CO的靶向输送。虽然以上固载和释放CO的材料研究都取得了一定的进展，但在CO释放时长、CO可控释放和材料本身的生物相容性等方面还有较大的提升空间。为了获得性能更好的CO释放材料，未来CO释放材料的研究可围绕以下三方面展开：1. 设计适配于病理微环境的CO释放材料，通过外部(如磁场、微波等非侵入式手段)或内部(如炎症部位的氧化应激环境)刺激实现CO的按需释放；2. 设计稳定性更好的CO供体或进一步修饰CO释放材料，延长生理环境下CO的释放时长，使其有可能用于慢性炎症性疾病如动脉粥样硬化、糖尿病足等的治疗；3. 在癌症治疗方面，同时将抗癌药与CO释放结合，可协同发挥抗癌功能并减少对正常细胞的损伤。

基金项目

国家自然科学基金NSFC：31971256。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。