1. 引言
近年来，土壤环境中不断被发现的抗生素引起了人们的极大关注，磺胺类抗生素是很容易在土壤等环境中积累的抗生素之一。兽药抗生素的排放是磺胺类抗生素污染土壤的主要原因。随着抗生素使用量的逐渐增加，全球每年仅兽用抗生素的消费总量就达100,000~200,000吨 [1]。兽药抗生素可以通过药物生产排放、污水处理排放、处理未使用的或过期的药物、坡面径流、施用投喂过抗生素的牲畜的粪便作为肥料等多个方式进入环境，其中，施用投喂过抗生素的牲畜粪便是最主要的途径 [2]。
土壤脱氢酶(DHA)是典型的土壤酶，可以用来表征土壤微生物的活性。目前，对于磺胺类抗生素在土壤环境中的研究主要集中于磺胺类抗生素对生物体的影响以及在整体土壤介质中的行为，为此，本研究通过单一及联合磺胺类抗生素在蚯蚓培养中心土壤及主体土壤中脱氢化酶活性(DHA)的变化进行测定，一方面可为准确评价磺胺类抗生素对土壤环境及人类健康的风险提供依据，另一方面可为磺胺类抗生素在土壤中的消解及去除提供资料参考，也可为磺胺类抗生素对人类健康的影响提供依据及研究思路。
2. 材料和方法
2.1. 供试材料
磺胺类药物作为广谱抗菌类药物被大量使用，其种类繁多，经过筛选，此次研究选用以下三种最为广泛使用的磺胺类抗生素：
磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole，简称为SMZ)，磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine，简称为SM1)，磺胺噻唑(sulfathiazole，简称为ST)。
磺胺甲恶唑、磺胺甲基嘧啶和磺胺噻唑均购自Sigma公司(St. Louis, MO, USA)，纯度均为98%以上，其他所用试剂均为分析纯或化学纯级别。
本实验选用的蚯蚓购于芦台蚯蚓养殖场，将蚯蚓带回实验室后要将其置于20℃条件下培养一段时间。实验前选取体重在300~600 mg之间的成熟健康个体，并且对蚯蚓进行清肠处理。
2.2. 实验方法
根据实验浓度的设置，将三种典型的磺胺类抗生素在单一及两两联合模式下与土壤混匀染毒后，分别放入对应的花盆中，盆中放置培养袋，将盆中土壤分为中心培养土和主体土，在每个培养袋中放入十条未受损的蚯蚓，用尼龙网封口。放置在光照培养箱中，温度设置在20℃左右(误差小于1℃)，以12小时光照和12小时黑暗交替培养模拟自然光照条件。培养到期后，先将蚯蚓取出，然后对蚯蚓培养中心土壤及主体土壤进行采样处理。
2.3. 测定方法
土壤脱氢酶活性的测定主要参照关松荫的方法 [3]，采用TTC比色法。
3. 结果与讨论
3.1. 磺胺类抗生素对蚯蚓培养中心土壤DHA的影响
脱氢酶普遍存在于活体微生物中，它催化底物去掉一个氢原子，是电子传递体系中催化有机质脱氢作用的第一酶，在有机质分解过程中具有关键作用。在土壤生态中，可以反映处理体系中微生物的量及其对有机物的降解能力 [4]。土壤脱氢酶能够促进土壤中有机物的脱氢，成为氢中间的传递体，其脱氢过程中产生的氢可以直接释放到空气中或传给醌型有机物。因此常用土壤脱氢酶表征土壤的肥力状况与土壤环境质量，通过检测其酶活性来研究环境化合物的毒性 [5]。
在不同浓度磺胺类抗生素作用下，蚯蚓培养中心土壤中DHA的浓度如图1所示。通过与空白对照组的对比可以得出：所用三种磺胺类抗生素无论是单一作用还是两两联合作用，都会降低培养土壤中DHA的活性。对比培养一月后和两个月后土壤中DHA的浓度可以看出，土壤中的DHA在培养一个月与两个月后均被显著抑制，且随着染毒时间延长，酶活性升高。同时，单一磺胺类抗生素对土壤DHA的抑制作用较联合磺胺类抗生素的抑制作用更加明显，且随着染毒浓度的增加，无论是在单一作用还是在联合作用的情况下，磺胺类抗生素对土壤DHA的抑制作用均减弱。此外，三种磺胺类抗生素单独作用时，SM1对土壤DHA起到最强的抑制作用，SMZ次之，ST的抑制作用最弱；三种抗生素两两联合作用时，通过比较也能得到对土壤DHA抑制作用的强弱顺序为：SM1 > SMZ > ST的结论。
Figure 1. Effects of sulfonamide antibiotics on DHA in earthworm center cultivated soil
图1. 磺胺类抗生素对蚯蚓中心培养土壤DHA的影响
3.2. 磺胺类抗生素对蚯蚓主体土壤DHA的影响
在不同浓度磺胺类抗生素(15 mg/kg、45 mg/kg)作用下，蚯蚓主体土壤DHA的浓度如图2所示。与空白对照组对比同样可得出所用三种磺胺类抗生素无论是单一作用还是两两联合，都会降低培养土壤中DHA的活性的结论。且土壤中的DHA在培养一个月与两个月后均被显著抑制，且随着染毒时间延长，酶活性升高，与中心培养土壤DHA相比变化趋势相同。同时，单一磺胺类抗生素对土壤DHA的抑制作用也比两两联合抗生素的抑制作用更强，且相比高浓度的磺胺抗生素，低浓度的抗生素会对土壤DHA产生更明显的抑制作用。此外，在主体土壤中，对土壤DHA起到抑制作用的抗生素同样是SM1最强、SMZ次之、ST最弱，且主体土壤中的DHA活性整体相较中心培养土壤中的DHA更低，降幅更小。然而有研究发现重金属或多环芳烃对土壤DHA活性的诱导作用 [6] [7]，这可能是由于污染物性质或受试生物种类的差异。
Figure 2. Effects of sulfonamide antibiotics on DHA in earthworm soil
图2. 磺胺类抗生素对蚯蚓主体土壤DHA的影响
4. 结论
1) 土壤DHA是一种具代表性的微生物胞内酶 [8]，如图1和图2所示，染毒一个月及两个月后，中心培养土壤中的DHA活性均被显著抑制，并随染毒时间延长，酶活性升高，主体土壤中的DHA活性变化趋势与中心培养土壤基本相同，只是酶活性比中心培养土显著降低。
2) 三种抗生素联合作用下对DHA的抑制作用均低于其单一作用效果，复合污染对土壤酶活性的效应与染毒浓度和土壤酶的种类相关。
基金项目
大学生创新项目国家级项目，项目编号：202013663001。