1. 引言
急性心肌梗死是临床中常见急症，也是成年人在日常生活及临床工作中引起猝死最常见的原因之一。急性心肌梗死早期不具有典型的形态改变，使判断死亡的原因造成困难，为了探讨组织化学染色方法对法医实践中的诊断及鉴别的帮助作用，进一步确定Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精法染色在急性心肌梗死猝死鉴定中的应用价值，本研究采用HE染色、Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色(铁矾–苏木素–伊红染色)和Heidenhain氏苏木精法染色对实验大鼠作比较性研究，以便寻找到简易可行、结果可靠的染色方法，为急性心肌梗死的早期形态诊断提供可靠依据。
2. 材料和方法
2.1. 材料
实验用SD大鼠均由宁夏医科大学实验动物中心提供，实验设备由宁夏医科大学基础医学院实验平台提供，急性心肌梗死猝死者心肌标本来自2016年~2018年病理学系法医病理检验案例。
2.2. 实验步骤
2.2.1. 分组
6~8周龄健康雄性SD大鼠19只，体重200~250 g，随机将大鼠分成假手术组5只，心肌梗死组9只和对照组5只。
2.2.2. 准备实验器材及试剂
狗兔二用解剖台、手术灯、电子秤、双凹夹、止血带、大鼠固定用泡沫砖、大头针、固定线、1 ml注射器、手术刀、手术剪、止血弯钳、眼科剪、培养皿、缝针、非吸收性外科缝线、无菌纱布、无菌棉球、一次性使用灭菌橡胶外科手套、生理盐水、水合氯醛(300 mg/kg)、利多卡因(1 mg/kg)、生理信号采集处理系统。各梯度乙醇，二甲苯，1%盐酸乙醇，苏木精，伊红，明矾苏木素液，碱性复红染色液，蒸馏水，纯丙酮，0.1%苦味酸纯丙酮液，5%硫酸铁铵溶液。
2.2.3. 麻醉
1) 称重：将大鼠放在电子秤上，读数并记录；
2) 计算麻醉剂量：大鼠腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)。
2.2.4. 冠状动脉左前降支结扎及关胸
1) 保持大鼠于自然呼吸状态，仰卧位固定于手术台，连接BL-420生物机能实验系统，记录心电图变化；
2) 大剪刀剪除大鼠胸前区毛，碘伏消毒，使用一次性灭菌橡胶外科手套；
3) 用手术剪沿大鼠胸骨左缘4~5肋间隙剪开皮肤约2 cm，围皮层切口做一荷包缝合(4针缝法)；
4) 用手术剪沿肌肉走行钝性分离胸大肌和前锯肌；
5) 助手持止血弯钳于胸骨左缘第4肋间稍用力穿透肋间肌进入胸腔，并迅速沿肋间隙方向撑开肋骨以暴露心脏；
6) 同时助手左手拇指置于左侧胸腋部，食指、中指、无名指置于大鼠右侧胸腋部，适当用力将心脏快速挤出；
7) 术者在左心耳与肺动脉圆锥交界处平左心耳下缘约2 mm处，以6-0带线缝合针快速结扎左冠状动脉前降支(LAD)，进针深度1.5~2 mm；
8) 结扎后立即将心脏放回胸腔，助手快速双手手指挤压两侧胸廓排出胸腔空气，同时术者拉紧荷包外科打结关闭胸腔，无菌纱布覆盖伤口 [1]；
9) 假手术组左冠状动脉前降支下心肌缝线，但不结扎；
10) 记录结扎后60、120、180 min II导联心电图。测定J点及T波电压，计算其变化值。
2.3. 染色方法
2.3.1. HE染色
1) 中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水；2) 放入苏木精染色5~20分钟；3) 水洗，显微镜下观察细胞核的深浅，推测分化的时间；4) 1%盐酸乙醇分化数秒；5) 水洗，显微镜下观察细胞核的深浅是否合适，决定是否蓝化或需要重染或再分化；6) 染色深浅适中的切片自来水蓝化5分钟；7) 伊红染数秒；8) 75% 85%乙醇洗涤30秒；9) 95%乙醇I洗涤0.5~2分钟；10) 95%乙醇II脱水2~5分钟；11) 无水乙醇I脱水2~5分钟；12) 无水乙醇II脱水2~5分钟；13) 二甲苯I透明1分钟；14) 二甲苯II透明1分钟；15) 中性树胶封固 [2]。
2.3.2. Nagar-Olsen染色
1) 中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水；2) 入明矾苏木素液10~30 s；3) 自来水5 min，用蒸馏水洗2次；4) 碱性复红染色液3 min；5) 蒸馏水洗5~10 s；6) 纯丙酮洗5 s；7) 0.1%苦味酸纯丙酮液迅速分化5~15 s；8) 纯丙酮脱水，二甲苯透明和中性树胶封固 [3]。
2.3.3. Heidenhain染色(铁矾–苏木素–伊红染色)
1) 切片脱蜡至水；2) 媒染于5%硫酸铁铵7 min；3) 水洗15 min；4) 苏木精液染色7 min；5) 水洗5 min；6) 5%硫酸铁铵分化(镜下控制到正常心肌纤维无色为止)；7) 流水冲洗10 min；8) 70%乙醇1 min；9) 伊红40 s；10) 85%乙醇40 s；11) 95%乙醇1 min；12) 无水乙醇1 min × 2次；13) 二甲苯1 min × 3次；14) 中性树胶封固 [4]。
2.3.4. Heidenhain氏苏木精法染色
1) 石蜡切片脱蜡至水；2) 5%硫酸铁铵水溶液中媒染60 min；3) 蒸馏水急洗5~10 s；4) 放入Heidenhain氏苏木精溶液内60 min；5) 以5%硫酸铁铵水溶液与蒸馏水1:1稀释分化并流水冲洗交替进行(镜下控制)；6) 流水冲洗10 min；7) 脱水、透明、树胶封片 [5]。
2.4. 判定标准
HE染色结果判定标准：正常心肌纤维染色为粉红色，胞质、胞核显示清晰，细胞膜完整，细胞排列规则，细胞间隙适中 [2]。
Nagar-Olsen染色结果判定标准：缺氧心肌、红细胞呈红色；正常心肌呈黄色或黄棕色，细胞核呈蓝色 [3]。
Heidenhain染色(铁矾–苏木素–伊红染色)结果判定标准：正常心肌纤维呈红色，胞核呈灰色；病变心肌呈黑褐色，缺血心肌、红细胞呈灰黑色 [4]。
Heidenhain氏苏木精法染色结果判定标准：正常心肌呈棕黄色，心肌纤维胞质内未见黑点；病变心肌梗死区大部分心肌纤维胞质内出现黑点，呈灶状或片状分布，胞核也呈黑色 [5]。
2.5. 统计学分析
应用SPSS19.0软件包进行分析，各组间阳性率比较采用χ2检验。各种方法比较采用秩和检验。
3. 结果
3.1. HE染色结果
对35例标本均进行了HE染色，对照组心肌纤维染色为粉红色，胞质胞核及组织结构清晰；急性心肌梗死组梗死区心肌纤维可出现凝固性坏死、核固缩、碎裂、消失，胞质均呈不规则粗颗粒状，间质水肿，有少量中性粒细胞浸润。非梗死区心肌纤维表现为细胞水肿，胞质红染，胞核无明显病变，与对照组心肌很难鉴别。
3.2. Nagar-Olsen染色结果
Nagar-Olsen染色显示对照组及假手术组心肌呈浅棕色，无艳红的缺氧心肌存在；急性心肌梗死组在梗死区周围可见心肌呈艳红色，呈灶状或片状分布。
3.3. Heidenhain染色结果
Heidenhain染色显示对照组心肌呈红色，无黑色的缺氧心肌存在；急性心肌梗死组梗死区大部分心肌纤维胞质内出现黑点，呈灶状或片状分布。
3.4. Heidenhain氏苏木精法染色结果
Heidenhain氏苏木精法染色显示，对照组及假手术组心肌呈棕黄色，心肌纤维胞质内未见黑点；急性心肌梗死组，梗死区大部分心肌纤维胞质内出现黑点，呈灶状或片状分布，胞核也呈黑色。
3.5. 不同染色方法在各组表达的结果
表1结果显示Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精染色在大鼠急性心肌梗死模型组中阳性表达率分别为70%，50%和50%；在急性心肌梗死猝死组中阳性表达率分别为73%，53%和53%；在正常心肌组表达均呈阴性。上述三种方法在以上两组的阳性表达率比较未见统计学差异(P > 0.05)。
Table 1. The positive rate of three kinds of histochemical staining in each group
表1. 三种组织化学染色法在各组表达的阳性率
与大鼠急性心肌梗死模型组及急性心肌梗死猝死组比较，*P < 0.01；三种方法两两经秩和检验比较P值分别为0.375，0.245，0.16。
4. 讨论
猝死是指平时看起来健康的人，因为潜在的自然疾病突然发作或者恶化，而发生的急骤性死亡。世界卫生组织将猝死定义为6 h内发生的非创伤性、不能预期的死亡，但更多学者主张定义为发病后1 h内死亡。其特点是急骤性和意外性。从病因学方面分类，根据其是否合并心血管疾病，猝死可分为心源性猝死(SCD)和非心源性猝死(非SCD)。SCD约占全部猝死病例的80%，而非SCD约占全部猝死的20% [6]。因此，应用病理学新技术，进行冠心病猝死的早期诊断的研究，成为法医病理学研究的重要课题之一。
虽然急性SCD的早期病理改变常规的组织病理学检查有时很难发现典型的形态学改变，但我们对各组标本均进行了HE染色，是为了确定梗死区的范围和观察梗死区边缘心肌缺血的病理变化。与此同时观察到在梗死区内有明显的细胞核的改变，而在三组染色标本中非梗死区心肌纤维的形态没有明显差别。因此HE染色在观察早期心肌缺血方面应以胞质的变化为主。其正常心肌主要表现为纤维染色为粉红色胞质、胞核及组织结构清晰；缺血心肌肌纤维浊肿、嗜酸性增强，心肌肌浆凝固、横纹不清或消失，呈波浪状改变。
寻找更灵敏有效且操作简便的染色方法并将其用于病理实践中，对鉴别和诊断早期心肌缺血具有非常重要的意义。特殊组织学染色灵敏度高、特异性强，价格低廉，是一种有实践价值的诊断早期心肌缺血性改变的方法。目前，主要常用于心肌缺血诊断的组织学染色方法有Heidenhain染色、Nagar-Olsen染色等。Heidenhain氏苏木精染色是一种传统的染色方法，用于细胞核的染色观察，能够清晰地显示染色体、染色质以及细胞质中线粒体的位置。除此之外，还可以使髓鞘染色。
本研究对上述三种特殊染色方法和HE染色进行比较，Heidenhain染色对照组心肌纤维染色为粉红色，胞浆、胞核及组织结构清晰；疑似心肌缺血缺氧组中有不同程度的心肌肥大、局灶性肌浆凝集、嗜酸性变等心肌缺血改变；心肌梗死组心肌改变明显，表现为心肌纤维浊肿、嗜酸性增强、心肌肌浆凝固、横纹不清或消失、呈波浪状改变，胞浆胞核结构消失，并有散在的中性白细胞浸润 [7]。同时，本研究也发现缺血15 min时Nagar-Olsen染色在左室心内膜及乳头肌处见点状心肌纤维阳性着色，并随缺血时间的延长阳性着色面积进一步扩大。该方法阳性结果清晰，对比度好，但要求实验人员技术熟练，特别是苦味酸丙酮浸润这一步兼有对比染色和分化的双重作用，分化程度较难掌握，浸染时间过长或过短可产生假阴性或假阳性结果 [8]。Nagar-Olsen染色在梗死区周围的心肌显示为明显的艳红色并大致勾勒出坏死的边缘，有助于确定梗死区的范围及面积。研究还显示Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精染色虽然方法不同，操作步骤不一样，但结果基本一致，且在急性心肌梗死组中，Heidenhain染色强阳性率为40%，显著高于Heidenhain氏苏木精染色的强阳性率20%。因此，文献中大多采用的是Heidenhain染色 [3]。
5. 结论
综上所述，Heidenhain、Nagar-Olsen和Heidenhain氏苏木精染色法均能运用于日常尸体检验和病理检查中，在常规取材和组织处理、石蜡切片等一般条件下，其能较好地显示心肌缺血和心肌梗死的形态改变。上述三种特殊染色方法应用于心源性猝死的诊断和鉴别且对提高心源性猝死的诊断和鉴别水平具有重要的促进作用。
基金项目
2019年大学生创新创业训练计划项目(S201910752032)。