复合维生素B片评价性抽验结果分析及含量测定方法的改进

Analysis of the Evaluation Test Results of Tabellae Vitamini B Compositae and Improvement the Quantitative Method

摘要: 目的：对四川省内2019年192批次评价抽验复合维生素B片检验结果进行统计分析，并对原有含量测定方法进行改进，增加了维生素B₆的含量检测。方法：采用高效液相色谱法同时测定供试品中维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆和烟酰胺的含量，考察方法的可行性及线性范围。结果：维生素B₁在7.488~73.162 μg∙mL⁻¹浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程：Y = 17.54886X − 13.71053，r = 0.9997；维生素B₂在3.683~36.582 μg∙mL⁻¹浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程：Y = 59.51908X − 9.12808，r = 0.9999；维生素B₆在0.522~5.127 μg∙mL⁻¹浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程：Y = 30.96344X − 0.61005，r = 0.9998；烟酰胺在24.651~249.208 μg∙mL⁻¹浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程：Y = 2.83243X + 3.49157，r = 0.9999；结论：采用该方法同时测定复合维生素B片中维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆和烟酰胺四种组分含量，具有样品处理简单、方便、快捷，定量结果准确、可靠等优点。

Abstract: Objective: To statistically analyze the test results of 192 batches of evaluation inspection Tabellae Vitaminin B Compositae samples in Sichuan Province in 2019, and to improve the original content determination method and increase the content determination of vitamin B₆. Method: Simultaneous determination of vitamin B₁, vitamin B₂, vitamin B₆, and nicotinamide in the test product by high performance liquid chromatography was performed to investigate the feasibility and linear range of the method. Results: The concentration of vitamin B₁ in the range of 7.488~73.162 μg∙mL⁻¹ showed a good linear relationship between the peak area and the concentration. The linear equation was: Y = 17.54886X − 13.71053, r = 0.9997; Vitamin B₂ is in the range of 3.683~36.582 μg∙mL⁻¹, the peak area and concentration have a good linear relationship, linear equation: Y = 59.51908X − 9.12808, r = 0.9999; Vitamin B₆ in the concentration range of 0.522~5.127 μg∙mL⁻¹, the peak area and concentration have a good linear relationship, linear equation: Y = 30.96344X − 0.61005, r = 0.9998; In the concentration range of nicotinamide from 24.651 μg∙mL⁻¹ to 249.208 μg∙mL⁻¹, the peak area has a good linear relationship with the concentration, a linear equation: Y = 2.83243X + 3.49157, r = 0.9999; Conclusion: The simultaneous determination of four components of vitamin B₁, vitamin B₂, vitamin B₆, and nicotinamide in Tabellae Vitamini B Compositae by this method has the advantages of simple, convenient, fast, and accurate quantitative results.

1. 引言

复合维生素B片，作为维生素类药物，收载于中华人民共和国卫生部药品标准化学药品及制剂第一册 [1] (一九八九年)，自1989年12月1日起开始执行以来，一直未有修订，沿用至今。主要用于营养不良、厌食、脚气病、癞皮病及因缺乏维生素B类所致的各种疾患的辅助治疗。查阅国家药品监督管理局网站，该品种共有生产企业118家，分布在30个省、自治区和直辖市。该品种处方简单，作用宽泛，价格便宜，深受老百姓喜爱，在市场上销量很大。

2. 评价性抽验样品情况

本次评价抽验样品包装规格均为100片/瓶，药用塑料瓶包装。共抽验了192个有效样品批次，生产厂家分布在12个省、自治区和直辖市。被抽样单位中医疗机构65家，零售企业37家，批发企业80家，连锁药店9家；使用环节抽样66个，流通环节抽样126个。

3. 评价性抽样检验结果

1. 总检验结果

全部样品按法定现行标准检验，均符合规定。

2. 分项检验结果与分析

1) 性状：合格率100%。

2) 鉴别：5项化学鉴别，合格率100%。

3) 检查：

重量差异：平均片重最小值为0.0662 g，平均片重最大值为0.0959 g，说明不同厂家在处方及生产工艺上存在差异；同一厂家的产品平均片重都比较接近，说明各厂的生产工艺都很稳定。

崩解时限：最短时间为1分钟，最长时间为14分钟。可以看出各生产企业之间崩解时限波动较大，另有同一企业生产的不同批次样品崩解时限也有较大差异。

4) 含量测定：

维生素B₁：采用重量法 [1] 测定，由于中间转移步骤较多，误差影响因素多，因而同一厂家的同批次产品测得的结果也有差异。最小值为91.1%，最大值为107.5%，极差为16.4%，全体样本平均值为98.7%，RSD%为3.5%。

维生素B₂：采用可见–紫外分光光度法 [1] 测定，最小值为90.6%，最大值为109.7%，极差为19.1%，全体样本平均值为101.2%，RSD%为4.8%。

烟酰胺：采用凯氏定氮法 [1] 测定，最小值为91.8%，最大值为104.2%，极差为12.4%，全体样本平均值为98.9%，RSD%为2.2%。

4. 探索性研究及其检验结果分析

4.1. 开展探索性研究项目及其目的

复合维生素B片为维生素类非处方药，每片含：维生素B₁ 3 mg、维生素B₂ 1.5 mg、维生素B₆ 0.2 mg、烟酰胺10 mg、泛酸钙1 mg，辅料为：淀粉、糊精、硬脂酸镁、羟丙纤维素、蔗糖。现行标准对维生素B₁、维生素B₂和烟酰胺3个组分分别用重量法、紫外–可见分光光度法和凯氏定氮法进行含量测定，方法烦琐，检验需要的样品量大(全检需要185片)，而且对维生素B6的含量未进行控制，仅仅依靠化学鉴别对维生素B6进行定性而不能定量，不利于对该药品质量的全面监管。

为了减少检验样品取用量，提高检验效率，对药品质量进行全面控制，我们查阅了资料，重点了解采用液相色谱法测定复合维生素B片各组分含量方面的文章。张媛媛、丁大中 [2] 采用超高效液相色谱法，建立复合维生素B片中维生素B₁、维生素B₂、烟酰胺及维生素B₆的超高效液相色谱含量测定方法；张晓娜、校瑞等 [3] 用高效液相色谱法，梯度洗脱，缩短了检测时间；徐硕、徐文峰等 [4] 亦建立了复合维生素B片中5种维生素含量的高效液相色谱测定方法；韩秀梅，祖述春 [5] 也采用HPLC法对复合维生素B片中维生素B₁、B₂、B₆的含量测定进行研究；我们发现多维元素片(21) [6] 的处方中也含有这几种维生素，其质量标准WS1-XG-005-2000-2010采用高效液相色谱法对维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆和烟酰胺的含量进行同时测定。因此，我们采用相同的色谱条件对复合维生素B片中维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆和烟酰胺的含量进行可行性研究，对方法进行改进，以期达到良好的分离效果，并将含量测定结果与采用现行标准测得结果进行了比较。

4.2. 方法

参考WS1-XG-005-2000-2010标准，初步建立了如下液相色谱方法：Target WP-C18色谱柱(十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂)；柱温30℃；流动相为庚烷磺酸钠溶液(取庚烷磺酸钠0.6 g，加冰醋酸6 ml与三乙胺1 ml，加水至1000 ml，用2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至3.80)和甲醇；流速为1.0 ml/min；检测波长为280 nm。理论板数按烟酰胺峰计算不低于1000，各峰之间的分离度应>1.5。

4.3. 仪器与试药

XS205DU电子天平(瑞士METTLER TOLEDO)，pH/电导率/离子对综合测试仪(瑞士METTLER TOLEDO)，Agilent 1260液相色谱仪；赛默飞Ultimate 3000液相色谱仪；对照品：维生素B1批号100390-201806含量97.9%；烟酰胺，批号100115-201604，含量99.9%；维生素B₂，批号100369-201504，含量98.2%；维生素B₆，批号100116-201705，含量100.0%，以上对照品均由中国食品药品检定研究院提供；庚烷磺酸钠、甲醇均为色谱纯，成都市科隆化学品有限公司生产；冰醋酸、三乙胺、氢氧化钠等试剂均为分析纯。

5. 结果分析

5.1. 流动相选择

初期我们参考WS1-XG-005-2000-2010标准，流动相中庚烷磺酸钠溶液与甲醇的比例设置为83:17，结果如图1所示，混合对照品HPLC色谱图中的色谱峰从左至右依次为烟酰胺、维生素B₆、维生素B₁、维生素B₂，维生素B₁和维生素B₂不能很好的分离，分离度为1.2，不符合要求(见图1)。

Figure 1. HPLC chromatograms of reference substances (before)

图1. 流动相变化前对照品HPLC色谱图

经过几次摸索试验，分别采用调整流动相比例、流速等方法，最终发现将流动相比例调整为庚烷磺酸钠溶液–甲醇(88:12)时，维生素B₁和维生素B₂的分离度变为2.0，能很好的分离(见图2)。

最后确定流动相比例为：庚烷磺酸钠溶液–甲醇(88:12)。

5.2. 线性关系

精密称取烟酰胺对照品62.90 mg置25 ml量瓶中，加5%冰醋酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为烟酰胺对照品贮备液；精密称取维生素B1对照品20.83 mg置25 ml量瓶中，加5%冰醋酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维生素B₁对照品贮备液；精密称取维生素B₂对照品14.92 mg置100 ml量瓶中，加5%冰醋酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维生素B₂对照品贮备液；精密称取维生素B₆对照品14.15 mg置25 ml量瓶中，加5%冰醋酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 ml置50 ml量瓶中，5%冰醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为维生素B₆对照品贮备液；精密量取烟酰胺对照品贮备液0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，维生素B₁对照品贮备液0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，维生素B₂对照品贮备液3 ml、4 ml、5 ml、6 ml、7 ml、8 ml，维生素B₆对照品贮备液0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，至50 ml量瓶中，配制6个级别的混合标准曲线工作溶液，微孔滤膜滤过，精密量取续滤液

Figure 2. HPLC chromatograms of reference substances (after)

图2. 流动相变化后对照品HPLC色谱图

20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果：各峰之间的分离度均符合要求，理论板数均不低于9000。维生素B₁在7.488~73.162 μg∙mL⁻¹浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程：Y = 17.54886X − 13.71053，r = 0.9997；维生素B₂在3.683~36.582 μg∙mL⁻¹浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程：Y = 59.51908X − 9.12808，r = 0.9999；维生素B₆在0.522~5.127 μg∙mL⁻¹浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程：Y = 30.96344X − 0.61005，r = 0.9998；烟酰胺在24.651~249.208 μg∙mL⁻¹浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，线性方程：Y = 2.83243X + 3.49157，r = 0.9999。

5.3. 样品测定

样品处理及对照品溶液配制(避光操作)：取本品20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当烟酰胺10 mg)，置100 ml量瓶中，加5%冰醋酸溶液适量，超声10~15分钟，放冷至室温，用5%冰醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，精密量取续滤液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。另取烟酰胺对照品约50 mg、维生素B₁对照品约15 mg和维生素B2对照品约10 mg，精密称定，置500 ml棕色量瓶中，加5%冰醋酸溶液适量，超声10~15分钟，放冷至室温，精密加入维生素B₆对照品溶液(精密称取维生素B₆对照品约10 mg，置50 ml量瓶中，用5%冰醋酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀) 5 ml，用5%冰醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，同法测定。按外标法以峰面积计算。

本次试验覆盖全部12个厂家样品共计20批次，由3名检验人员分别采用不同厂家三个型号仪器测定，各组分含量限度均设为90.0%~110.0%。维生素B₁、维生素B₂、烟酰胺的含量测定结果与按现行标准测定结果非常接近，各组分含量测定平行偏差均符合要求。

20批次样品中，只有3个厂家4个批次样品维生素B₆含量测定结果符合规定且平行试验偏差符合要求。

5.4. 重现性试验

取样品(YP2019A0236)，依法处理6份，测定维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、烟酰胺含量，RSD分别为0.4%、0.8%、1.2%和0.6%，表明方法的重现性良好。

5.5. 加样回收试验

选取维生素B₆含量测定结果符合规定且平行试验偏差符合要求两个批次样品(YP2019A0236, YP2019A352)进行加样回收试验，烟酰胺平均回收率为95.4% (RSD%: 0.7%)，维生素B₆平均回收率为95.0% (RSD%: 1.2%)，维生素B₁平均回收率为103.3% (RSD%: 1.4%)，维生素B₂平均回收率为98.8% (RSD%: 0.9%)，均符合《中国药典分析检测技术指南》 [7] 相关要求。

5.6. 重复性试验

取对照品溶液，连续进样5次，烟酰胺峰面积测量值的相对标准偏差为0.7%，维生素B₆峰面积测量值的相对标准偏差为0.4%，维生素B₁峰面积测量值的相对标准偏差为0.3%，维生素B₂峰面积测量值的相对标准偏差为0.2%，均符合要求(应不大于2.0%) (见图3)。

Figure 3. HPLC chromatograms of Mixed reference substances (Repetitive tests)

图3. 混合对照品HPLC色谱图(重复性试验)

5.7. 稳定性试验

供试品溶液室温(25℃)放置48小时后测定，烟酰胺含量结果相对平均偏差为0.3%，维生素B₆含量结果相对平均偏差为0.0%，维生素B₁含量结果相对平均偏差为0.0%，维生素B₂含量结果相对平均偏差为0.7%，表明供试品溶液在48小时内稳定，能够满足检测的要求。

6. 讨论

本品处方由5种药物组成，现行标准仅对其中维生素B₁、维生素B₂、烟酰胺三个组分的含量进行了控制，对维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆和烟酰胺四个组分进行了化学鉴别，而对另一组分泛酸钙则没有相关的鉴别项。因检测标准项目缺失，可能造成厂家少投料或不投料，从而影响药品质量，损害广大患者的合法权益。同时由于没有进行含量均匀度检查，可能造成不良反应或药物达不到有效浓度影响治疗效果。

在生产工艺上，原辅料混合制粒过程中，由于维生素B₆分散不均匀，多批次样品维生素B₆含量测定平行试验结果不符合要求。《中国药典》2015年版四部片剂制剂通则规定：原料药物与辅料应混合均匀。含药量小或含毒、剧药的片剂，应根据原料药物的性质采用适宜方法使其分散均匀。处方中维生素B₆含量是最低的，药物与辅料的量比相差太大，用普通混合法不易混匀。现行质量标准又没有规定对维生素B₆的含量进行检测，厂家缺乏改进生产工艺的动力。建议厂家在混合的时候，最好采用递加稀释法和溶剂分散法，并在混合过程中增加过筛次数。

本次评价抽验有效样品192批，按现行标准检验，均符合规定。说明各生产厂家均能按照现行标准进行生产，但对标准未明确规定的制剂通则项下样品均一性问题，多数厂家没有很好的把控，也没有进行相关生产工艺的研究与改进，建议尽快对现行标准进行修订，改进含量测定方法，增加维生素B₆含量检测，同时增加含量均匀度项目检查，促进厂家改进生产工艺，确保药品质量提高，保障广大人民群众用药安全有效。