1. 引言
维生素D是调节人体内钙磷稳态方面的脂溶性类固醇，主要以维生素D2和维生素D3存在。经肝脏转化生成了主要形式25(OH)D；再进一步经肾脏转化为25(OH)D3。有文献证明，维生素D对男性生殖功能有着非常重要的作用，与男性生殖功能、睾丸功能和精子的发生有着紧密的联系 [1]。目前生殖功能问题已经引起广泛关注，越来越多的人来探究男性生殖功能的影响。已有研究表明维生素D对男性睾酮、性激素的合成有一定的影响，对男性的生殖与生育能力有一定的作用 [2]。同时，研究进一步表明维生素D能提高精子前向运动和射精前向运动的百分率来治疗少精症和弱精症 [3]。此外，相关证据表示血清中维生素D的活性成分25(OH)D3浓度太高或太低也会降低精液质量 [4]。但是，高剂量的1α,25-(OH)2D3会导致高磷血症、高胆固醇和高钙血 [5] [6]。因此，一定量的维生素D摄取可能会影响到男性生殖功能。
已有相关动物研究证明，正常维生素D的雄性大鼠和体内缺乏维生素D的雄性大鼠相比，维生素D缺乏组交配成功的概率明显低于正常维生素D组，而且缺乏组的精子活力相较正常组明显降低 [7]。此外对谷氨酰转肽酶活性进行研究发现，相较正常维生素D雄性大鼠的精原干细胞，在缺乏维生素D的雄性大鼠组织中，精原干细胞的功能明显受损，并且睾丸和附睾组织中的精子数量显著降低，生发上皮退行性的改变 [8]。进一步研究结果表明，雄性小鼠睾丸组织中维生素D受体缺失导致体内维生素D降低，与正常野生型小鼠相比，小鼠的睾丸组织的异常率增加，生殖细胞增殖减少，凋亡增多，生精过程异常，精子数量与精子活力明显降低 [9]。
虽然目前已有大量研究报道人体中维生素D影响男性生殖功能，并且在动物实验中，已经证实维生素D对雄性动物的精液质量和睾丸功能力都有影响。但是饮食中维生素D摄取不足是否导致血清中25(OH)D3含量下降，从而影响生殖功能还需要进一步探究。因此，本研究将建立大鼠维生素D饮食不足(VDI)暴露模型，研究其维生素D摄入不足是否对其精子发生产生不良影响，为维生素D对男性生殖功能中的研究提供更多的证据。
2. 材料
Sprague-Dawley (SD)雄鼠购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，4周龄，110~140克，共12只。动物实验经过湖南师范大学伦理道德委员会的批准，并且严格按照相关的操作指南进行。SD雄鼠饲养在湖南师范大学医学院清洁级动物房中，4只一笼，前2周予以普通环境进行适应，后12周保持12 h光照，12 h黑暗，温度范围：20℃~25℃，水和食物自由摄取。由深圳睿迪生物科技有限公司提供本实验所用地饲料，维生素D缺乏饲料其中维生素D含量5 IU/kg，对照饲料含有1000 IU/kg的维生素D。
3. 实验方法
3.1. 维生素D对SD雄性大鼠体重、身高和睾丸重量的影响
本研究分为两组，低维生素D饮食喂养的低维生素D组(VDI组)与正常饮食喂养的维生素D组(VD组)，在喂养的第0、2、4、6、8、10、12、14周分别用电子天平测量体重，在喂养14周后量取两组身高，并处死后用分析天平称取两组大鼠睾丸、附睾重量，并计算左右两侧睾丸重量。
3.2. 血清相关指标测定
SD雄性大鼠在18周龄时，禁食12 h后称体重，用3%的戊巴比妥纳溶液按1 ml/kg进行麻醉，然后固定在泡沫板上，进行腹主动脉采血，常温3000 r离心10 min分离血清，采用全自动生化检测仪测总25(OH)D水平，以及血清碱性磷酸酶(AKP)，血清磷(P)，血清钙(Ca)水平。
3.3. 精子密度测定
解剖大鼠，迅速剪取双侧附睾尾和输精管，分为数段，置于5 ml培养皿中，加入5 ml已预热的PBS，于37℃培养箱中孵育30 min，制备精子悬液。取10 μL精子悬液滴于干净的精子计数板上，盖上盖玻片，将计数板放在低倍镜下观察记录记数板上的精子数量，计算精子悬液精子密度。
3.4. 睾丸切片的制作
将睾丸组织迅速取下来戳破放入4%多聚甲醛溶液中固定过夜。将固定好的睾丸组织剪成适量大小，并保证平整，做好标记。再依次放入95%酒精，无水乙醇进行脱水；待二甲苯溶液浸泡透明后置于石蜡溶液包埋，迅速降温冷却；载玻片无水乙醇过夜，干燥后APES防脱片胶；将包埋的蜡块在切片机上切片，标记；将切片放于60℃烤箱里放置24 h。
3.5. 苏木素–伊红(H & E)染色
将制作好的切片放入二甲苯中浸泡，然后置于不同浓度的酒精中，按照梯度依次浸泡；清水冲洗干净切片后，再用苏木素进行染色；之后再流动水下冲洗干净染液，用1%盐酸酒精冲20 s；再用清水浸泡5 min后，用伊红染色，切片用清水冲洗干净；再次置于不同浓度酒精中按梯度浸泡，二甲苯中浸泡进行脱水；最后用中性树胶固定。
3.6. 免疫组织化学染色
将脱完蜡的切片放在清水下冲洗；放入3%甲醇–H2O2泡10 min，取出冲洗干净后用PBS洗3遍；再放入枸橼酸缓冲液中加热至沸腾，放于室温，待冷却后用PBS冲洗3遍；等切片干燥后滴加兔抗PCNA (1:400)一抗，4℃冰箱孵育过夜；第二天用PBS冲洗后滴加兔抗鼠IgG二抗，37℃孵育30 min后PBS冲洗。滴加100 μL DAB液进行显色后用清水反复冲洗多余的显色液；再用苏木素复染，清水冲洗干净再用1%盐酸酒精冲，然后用清水进行返蓝。之后按照酒精梯度浸泡，再泡入二甲苯中进行脱水。最后中性树胶封片。
3.7. 统计学方法
实验数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析，以均数 ± 标准差(Mean ± SD)表示，两组之间的比较采用两独立样本t检验，多组之间相比较采用单因素方差分析，如若方差齐采用LSD法，如若方差不齐，则采用Dunnett’s T3法检验。P < 0.05则表示有差异，具有统计学意义。
4. 结果
4.1. 维生素D不足对雄鼠体重、身长、睾丸重量的影响
研究维生素D对SD雄性大鼠体重与身高的影响，并计算左侧睾丸和右侧睾丸重量。结果显示：在SD雄性大鼠中，两组大鼠第1周到第14周体重和体长均明显增加，但与VDI组相比，VD组大鼠体重与身高无明显统计学差异，并且大鼠左侧睾丸和右侧睾丸重量比值之间均无显著差异(见表1，表2，图1)。
4.2. 维生素D不足对雄鼠血清学指标的影响
研究维生素D不足对雄鼠血清学指标的影响，大鼠处死前用腹主动脉采血用全自动生化检测仪检测，结果显示：与VD组相比，VDI组的25(OH)D水平明显降低(36.63 ± 2.31 vs. 28.41 ± 3.26，P < 0.01)，血清中AKP含量与VD组比较VDI明显下降(95.43 ± 24.41 vs. 58.20 ± 11.82，P < 0.05)，差异具有统计学意义。两组之间P、Ca离子含量无明显差异(见图2)。
Table 1. The effect of vitamin D on the body weight of SD male rats
表1. 维生素D对SD雄性大鼠体重的影响
Table 2. The effect of vitamin D on the left and right testes of SD male rats
表2. 维生素D对SD雄性大鼠左右睾丸的影响
Figure 1. (a): The weight change of two groups of SD male rats; (b): The effect of vitamin D on the body length of SD male rats; (c): The effect of vitamin D on the left and right testes of SD male rats. VD: Control Group, VDI: Processing Group
图1. (a)：两组SD雄性大鼠的体重变化；(b)：维生素D对SD雄性大鼠身长的影响；(c)：维生素D对SD雄性大鼠左右睾丸的影响。VD：对照组，VDI：处理组
Figure 2. (a): Histogram of the effect of vitamin D on serum 25(OH)D; (b): Histogram of the effect of vitamin D on serum phosphorus ions; (c): Histogram of the effect of vitamin D on serum calcium ions; (d): Vitamin Histogram of the effect of D on the content of alkaline phosphatase in the serum. VD: Control Group, VDI: Processing Group. *P < 0.05, **P < 0.01 vs. VD
图2. (a)：维生素D对血清25(OH)D的影响结果柱状图；(b)：维生素D对血清磷离子的影响结果柱状图；(c)：维生素D对血清钙离子的影响结果柱状图；(d)：维生素D对血清里碱性磷酸酶含量的影响结果柱状图。VD：对照组，VDI：处理组，*P < 0.05，**P < 0.01 vs. VD
4.3. 维生素D不足对雄鼠精子密度的影响
测定维生素D不足对雄鼠精子密度的影响。结果显示：VD组和VDI组的大鼠精子密度相比较，VDI组的精子数量有降低但与VD组相比无统计学差异(1.98 × 107 ± 8.78 × 106 vs. 1.65 × 107 ± 7.04 × 106, P > 0.05)。见图3。
Figure 3. Histogram of the effect of vitamin D on the sperm count of SD male rats. VD: Control Group, VDI: Processing Group
图3. 维生素D对SD雄性大鼠精子数量的影响结果柱状图。VD：对照组，VDI：处理组
4.4. 维生素D不足对雄鼠睾丸形态的影响
为了进一步验证维生素D饮食对大鼠生殖功能是否有影响，取出两组大鼠睾丸，进行切片染色，随机观察镜下100个睾丸细胞横截面情况。结果显示：睾丸细胞切片中有少许空泡、细胞脱落和无精子的现象，但VD组与VDI组相比结构无明显统计学差异(见图4)。
4.5. 维生素D不足对雄鼠睾丸PCNA表达的影响
为了研究维生素D睾丸中的表达，对睾丸PCNA蛋白检测。我们发现两组雄鼠睾丸细胞中都有PCNA阳性细胞表达，对两组雄鼠的睾丸切片随机选取20个横切面进行观察并计数，结果证明两组之间比较无明显差异(见表3，图5)。
Table 3. The number of PCNA (proliferating cell nuclear antigen) positive cells in testis tissue
表3. 睾丸组织PCNA (增殖细胞核抗原)阳性细胞的数目
VD：对照组，VDI：处理组。
(a) 
(b) 
(c)
Figure 5. (a): Cross-section of testis in VD group; (b): Cross-section of testis in VDI group; (c): Bar graph of PCNA (proliferating cell nuclear antigen) positive cell count results of testicular cells in the two groups. VD: Control Group, VDI: Processing Group. Microscope multiple: ×200 (Red Marker: proliferating cell nuclear antigen) positive cell
图5. (a)：VD组睾丸切片横截面；(B)：VDI组睾丸切片横截面；(c)：两组睾丸细胞PCNA (增殖细胞核抗原)阳性细胞计数结果柱状图。VD：对照组，VDI：处理组，显微镜倍数：×200 (红色箭头：PCNA阳性细胞)
5. 讨论
1α,25-(OH)2D3是维生素D3的类固醇激素，影响细胞周期，激活PKC、MAPK、PLA、PKA、PI-3K分子，从而使体内的钙离子变化，最终影响细胞的增殖与凋亡 [10]。大量的研究表明维生素D缺乏的雄性大鼠交配成功的概率比没有缺乏的雄性大鼠明显要低，而且这类雄性大鼠的精子活力和成功受孕的概率也比正常维生素D的雄性大鼠也要低 [11]。进一步研究发现，对维生素D缺乏的雄鼠补充维生素D和雌二醇激素时，发现小鼠的生育能力得到了明显提升，证明了维生素D与鼠的生殖能力相关 [12]。
但是，也有研究表明，动物体内中维生素D3和1α,25-(OH)2D3水平与总睾丸酮和游离睾酮之间没有明显的相关性 [7] [13] [14] [15] [16] [17]，维生素D并未导致生殖能力出现明显降低，所以现阶段关于维生素D影响男性生殖能力的结论并不一致。同时，最新研究表明维生素D3与精子总睾丸酮也没有明显的相关性 [18] [19] [20] [21]。因此，目前关于维生素D对男性生殖功能的影响结果各异且还具有争议，这值得我们进一步探究。
本研究探究了维生素D摄取不足时对大鼠睾丸生殖的影响。证实了正常雄性大鼠在维生素D摄取不足时对其生殖的影响。在本实验中，我们首先建立了动物模型，将SD雄性大鼠随机分为两组：1) VDI组给予低维生素D饮食喂养14周；2) VD组给予正常含量维生素D饮食喂养14周。平均两周记录一次大鼠体重，喂养第14周后集体处死，并记录身长、体重和左右睾丸重量。结果表明，VDI组与VD组比较，两组的体重，身长，左右侧睾丸重量的差异均无统计学意义(P > 0.05)。VD摄取不足并不会影响大鼠的生长。我们进一步对饲养14周后的大鼠进行血清指标的检测，测定维生素D(25(OH)D)、血清钙、血清碱性磷酸酶和血清磷。测定结果表明与VD组比较，VDI组血清25(OH)D水平明显降低(P < 0.01)，血清碱性磷酸酶含量明显下降(P < 0.05)。证明维生素D摄取不足确实会导致体内维生素D的降低，但是，低维生素D饮食只是导致体内维生素D不足的状态，而非缺乏的状态。在取血后对大鼠进行处死，取出大鼠附睾制作精子悬液，并用精子计数器计算精子数量，与VD组比较，VDI组附睾精子密度下降但无统计学差异(P > 0.05)；这证明维生素D摄取不足导致的维生素D降低并未影响到精子密度。最后取大鼠两侧睾丸组织石蜡包埋后制作切片，HE染色观察睾丸形态发现：与VD组相比较，VDI组睾丸细胞切片中有少许空泡、细胞脱落和无精子的现象，但两组差异无统计学意义(P > 0.05)，这证明维生素D摄取不足导致的维生素D降低并未对睾丸细胞造成显著影响。同时，PCNA调节细胞周期，参与细胞增殖，阳性细胞的多少可以作为生精过程中判断增殖的指标 [22]。PCNA免疫组织化学染色证明，两组模型大鼠间 PCNA蛋白表达的差异无统计学意义(P > 0.05)，进一步证明维生素D摄取不足也并未引起睾丸细胞的增殖变化。
本研究存在一定局限性。本研究中只是在一定周期内，对正常雄性大鼠在维生素D摄取不足进行探究，并未探究更长周期的维生素D摄取不足，会不会导致雄性大鼠体内维生素D进一步降低。同时，维生素D只是一定程度的降低，没有进一步降低体内维生素D水平来检测对睾丸生殖细胞的影响，尚不能确定大鼠体内维生素D进一步降低到一定程度是否也不影响睾丸生殖功能。这些将是笔者今后研究中探讨的问题。
6. 结论
综上，我们的研究表明大鼠维生素D饮食不足时，只导致血清25(OH)D下降和大鼠附睾中精子密度有下降趋势，但其下降量并未导致度睾丸明显的形态学变化和PCNA蛋白表达差异，因此，正常雄性大鼠仅仅维生素D摄取不足对大鼠的睾丸生殖功能并未有显著影响。
NOTES
*共同第一作者。
#通讯作者。