两种施氮条件下大豆品质性状QTL分析

QTL Analysis of Soybean Quality Traits under Two Nitrogen Application Conditions

摘要: 大豆是全球范围内食用蛋白和食用油脂的主要来源，同时也是动物饲料蛋白的最为重要的来源。大豆生长过程中，氮素的缺乏会严重影响大豆生长和发育，进而影响大豆产量和品质。目前关于氮素对大豆产量和品质的影响，已经有了大量研究报道，但是缺乏不施氮处理下大豆品质性状QTL分析的相关报道。本研究利用杂交组合“东农L13 × 黑河36”、“东农L13 × 合农60”衍生的两个重组自交系群体RIL3613和RIL6013为材料，在哈尔滨、阿城和双城3个地点进行正常施用氮肥和不施用氮肥两种条件种植，对大豆品质性状进行加性和上位性QTL定位，并对各性状进行氮肥响应QTL定位和候选基因预测，旨在剖析不同氮肥水平下大豆品质性状的遗传基础，发掘相关基因位点，为不同氮肥施用条件下的大豆分子设计育种提供技术和理论支撑，在RIL3613和RIL6013群体中共检出4个蛋白质含量加性QTL、2个油分含量加性QTL，单个加性QTL可解释0.20%~8.70%、7.23%~7.50%的表型变异。其中有1个油分含量加性QTL是新发现的。在RIL3613和RIL6013群体中共检出4对蛋白质含量上位性QTL，上位性QTL可解释4.04%~5.50%的表型变异。在RIL3613和RIL6013群体中共检出2个蛋白质含量氮肥响应QTL，单个氮肥响应QTL可解释8.88%~12.49%的表型变异，均是新发现的。利用SoyBase在线程序获得的标记信息，在4个一致QTL区间中，利用GO和KEGG数据库对1215个候选基因进行了筛选和注释。KEGG通路中，Ko04075参与植物激素信号转导途径，包括赤霉素、生长素、脱落酸等激素，在调节茎生长、植物生长和种子发育方面起着重要作用。基于Pathway分析和功能注释，最终鉴定出15个候选基因，被注释为囊泡转运v-SNARE家族蛋白基因、带有beta亚基和-2亚基基因的协同分子、SAUR样生长素应答蛋白家族基因、蔗糖非发酵相关蛋白激酶(SnRK)等，均是植物产量和品质形成等多种发育途径所必需的。

Abstract: Soybean is the main source of edible protein and edible oil worldwide, and the most important source of animal feed protein. In the process of soybean growth, nitrogen deficiency will seriously affect the growth and development of soybean, and then affect the yield and quality of soybean. At present, there have been a lot of research reports on the effects of nitrogen on soybean yield and quality, but there is a lack of related reports on QTL analysis of soybean quality traits under nitrogen application. In this study, two recombinant inbred lines (RIL3613 and RIL6013) derived from hybrid combinations “Dongnong L13 × Heihe 36” and “Dongnong L13 × Henong 60” were used as materials to plant under two conditions of normal application of nitrogen fertilizer and no application of nitrogen fertilizer at three locations in Harbin, Acheng and Shuangcheng. For soybean quality traits, additive and epistatic QTL mapping, QTL mapping and the various characters are nitrogen response and candidate gene prediction, which aims to analyze the genetic basis of soybean quality traits under different nitrogen levels, explore related gene loci, for different conditions of soybean nitrogen molecular design breeding to provide technical and theoretical support. Four additive QTLs for protein content and two additive QTLs for oil content were detected in RIL3613 and RIL6013 populations, and a single additive QTL could explain 0.20%~8.70% and 7.23%~7.50% of the phenotypic variation. One additive QTL for oil content was newly discovered. A total of 4 pairs of epistatic QTLs for protein content were detected in RIL3613 and RIL6013 populations, and epistatic QTLs could explain 4.04%~5.50% of the phenotypic variation. Two QTLs for nitrogen response to protein content were detected in RIL3613 and RIL6013 populations, and a single QTL for nitrogen response could explain 8.88%~12.49% of the phenotypic variation. Using the tagged information obtained by Soy Base online program, 1215 candidate genes were screened and annotated in four consistent QTL intervals using GO and KEGG databases. In the KEGG pathway, Ko04075 is involved in plant hormone signal transduction pathways, including gibberellin, auxin, abiotic acid and other hormones, and plays an important role in regulating stem growth, plant growth and seed development. Based on Pathway analysis and functional annotation, 15 candidate genes were identified, which were annotated as vesicle-transporter V-SNARE family protein gene, comolecule with Beta subunit and 2 subunit gene, SAUR like auxin response protein family gene, sucrose nonferment-associated protein kinase (SnRK), etc. are necessary for many developmental pathways such as yield and quality formation.

1. 引言

大豆是重要的油料作物，是榨油及优质饲料的重要原料。大豆籽粒含有丰富的优质食用蛋白，是植物蛋白的重要来源之一。大豆油以其营养均衡全面、口感风味佳等优势一直以来深受人们喜爱。大豆在氮素利用研究方面已有广泛报道，作为自身具有固氮功能的作物，大豆氮素供给、吸收及利用机制复杂，进行深入研究具有很重要的实际意义。大豆在生长过程中，氮素的缺乏会严重影响大豆生长和发育，进而影响大豆的产量和品质。目前关于大豆氮素对品质的影响相关研究报道较少，缺乏氮素对大豆品质性状影响的分子研究机制。

大豆油分含量和蛋白质含量是重要的品质性状，目前许多关于大豆蛋白质含量和油分含量的QTL定位研究在国内外已有报道，并且已有超过200个位点被相继报道，广泛分布于大豆的20条染色体连锁群上。这些研究利用的作图群体不同，遗传背景具有较大差异，因此研究获得的QTL稳定性与重复性较差，仅能适用于特定遗传背景或杂交群体的分子辅助选择。现将关于大豆品质性状，主要包括油分含量及蛋白质含量QTL定位研究进展进行如下综述。

1992年，Diers等 [1] 利用RFLP标记对G. max和G. soja杂交构建F_2:3群体进行品质性状QTL分析，共定位了9个与油分含量、8个蛋白质含量相关的QTL。1999年，Orf等 [2] 在4个环境下定位了6个油分含量QTL、5个蛋白质含量QTL，所用群体为3个重组自交系(RILs)群体，遗传标记为简单序列重复(SSR)标记和扩增片段长度多态性(AFLP)标记，亲本为“Minsoy、Noir1和Archer”三个，在两个群体中多数QTL只在一个群体中被检测到，不能在三个群体中同时被检测到。2013年，Pathan等 [3] 利用亲本组合为“Magellan × PI438489B”和“Magellan × PI567516C”衍生的两个重组自交系群体(RILs)，以900个SSR和SNP标记为基础，在两个环境下检测到了7个蛋白质含量QTL，6个油分含量QTL，其中有2个QTL可以同时控制两个性状，分别分布在第5和第6号染色体上。2019年，Karikari等 [5] 基于一套高密度遗传图谱，共检测到了与大豆蛋白质含量和油分含量相关的QTL 44个，这44个QTL是在6个环境中被检测到的，有15个QTL是本研究首次发现的，其中qOil-8-3、qPro-7-1、qOil-15-2和qOil-10-4为多环境下检测到的稳定QTL，贡献率均大于10%，并在这4个物理区间内筛选出111个候选基因直接或间接参与种子蛋白质和油分生物合成或代谢过程，经过进一步RNA-seq分析，有15个潜在候选基因在种子发育阶段和根瘤期高表达。

近年来，关于大豆油分含量及蛋白质含量QTL定位研究中共获得了不同群体及遗传背景间存在的大量QTL [8] [9]，但不同群体间QTL稳定性与重复性还是相对较差，需要对众多QTL进行进一步整合分析及交互群体验证。本研究以前期创建的大豆重组自交系群体(RILs)为试验材料，在不同氮肥水平下，对大豆品质等相关性状进行了QTL定位及候选基因挖掘研究，为进一步开展不同氮肥水平下大豆品质形成的分子网络调控机制以及分子标记辅助选择奠定了理论基础和技术支撑。

2. 材料与方法

2.1. 遗传群体

将东农L13、黑河36和合农60配置为2个杂交组合(见表1)，分别为“东农L13 × 黑河36”和“东农L13 × 合农60”，F₂至F₆在哈尔滨(E128˚，N45˚)与海南崖城穿叉种植，每个世代采用单粒传方法处理，在F_2:6将单株种成株行，在F_2:7剔除混杂株行，形成两个重组自交系群体，各包含134个和156个株系，分别简称RIL3613和RIL6013。

Table 1. Quality traits of three parents in RIL3613 and RIL6013

表1. RIL3613和RIL6013三个亲本的品质性状

2.2. 田间试验设计

田间试验于2016年在阿城(E1)、双城(E2)和哈尔滨(E3)三个地点同时进行，将东农L13、黑河36和合农60等3个亲本和2个RIL (RIL3613和RIL6013)群体在田间种植。田间试验采取裂区设计，主处理施氮肥处理，副处理为RIL群体。氮肥施用包含两个水平，一个为正常施氮肥(N₊，75 Kg N/ha、150 Kg P₂O₅/ha、75 Kg K₂O/ha)，一个为不施氮肥(N₋，150 Kg P₂O₅/ha、75 Kg K₂O/ha)。种植规格为三行区，3 m行长，0.7 m行距，0.07 m株间距，两次重复 [6]。田间管理同一般大田栽培。

2.3. 性状调查

对每个小区种子收获后，在籽粒含水量达到干重的10%左右时，检测其蛋白质含量(PC)和油分含量(OC)。蛋白质和油分含量使用东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室的近红外谷物分析仪(FOSS 1241，丹麦)进行检测，该仪器的校正回归系数采用偏最小二乘法(Partial Least Square, PLS)，将光谱数据与实验室数据(Kjeldahl方法)相结合计算籽粒中的蛋白质和油分含量，结果以占籽粒重量百分比的形式描述。每个小区随机测定3次重复，测定完成后，计算出每份材料3次重复的平均值，以此作为该小区的表型数据进行分析。

2.4. 遗传图谱的构建

从2005年的大豆公共图谱上初步挑选了838对SSR引物，大豆公共图谱可在网站上查询(http://www.soybase.org)，利用筛选得到的838对SSR引物在RIL3613和RIL6013两个群体各自的亲本间进行多态性筛选，最终在RIL3613群体中筛选出156对表现好的多态性引物，在RIL6013群体中筛选出137对表现好的多态性引物。应用大豆SSR序列合成引物，这些SSR序列是由Soybase网站提供的，然后利用筛选出来的293对表现良好的多态性引物对亲本及RIL3613和RIL6013的290个后代株系进行PCR扩增。

应用IciMapping 4.0软件(http://www.isbreeding.net/software/)构建大豆的遗传连锁图谱，首先进行PCR产物电泳(使用6%的聚丙烯酰胺凝胶)，其次记录SSR带型(亲本和后代株系的SSR带型)，再次录入带型数据，最后根据两个群体SSR标记的基因型构建出大豆的遗传连锁图谱。构建的RIL3613群体的遗传图谱含有156对 SSR 引物，包含20个连锁群，该图谱覆盖基因组的遗传距离为2848.56 cM，单个连锁群的遗传距离范围为1.15~283.42 cM，标记间的平均遗传距离为18.99 cM，标记数的范围为2~13个；RIL6013群体的遗传图谱也包含20个连锁群且含有137对SSR引物，该图谱覆盖基因组遗传距离为1886.8 cM，单个连锁群遗传距离范围为19.68~163.67 cM，标记间平均遗传距离为13.77 cM，标记个数范围为4~11个 [10]。

2.5. 数据统计分析

2.5.1. 表型数据的变异分析

应用Excel2010软件对每个环境下各氮肥处理不同性状的平均数进行描述性分析，分析平均数、标准差、偏度、峰度、最小值和最大值。

对每个环境下各性状平均数进行方差分析，包括氮肥间、基因型效应和基因型 × 氮肥间互作效应的方差分析，同时估计了方差分量，并通过下面这个公式进一步估计了遗传率。

$h^2=\frac{{\sigma }_g^2}{{\sigma }_g^2+{\sigma }_{GN}^2/n+{\sigma }^2/(\; r\; n\; )}$

其中 $h^2$ 为遗传率， ${\sigma }_g^2$ 为遗传方差， ${\sigma }_{GN}^2$ 为基因型 × 氮肥间互作方差， ${\sigma }^2$ 为误差方差，g是家系个数，d是氮肥水平数。

在每个环境下分析各氮肥各性状间相关系数。

方差分析及 ${\sigma }_g^2$ 、 ${\sigma }_{GN}^2$ 、 ${\sigma }^2$ 的估计通过SAS V9.2软件的PROC Mixed过程实现。

2.5.2. 氮肥响应

为探索大豆各性状对氮肥变化的响应，针对三个地点的不同氮肥试验数据进行氮肥响应QTL分析。氮肥响应(Response to Nitrogen, RN)应用Zhu等 [11] 的条件变量方法分析，即是施氮肥的性状表型扣除不施氮肥遗传背景后获得的条件变量。具体计算方法如下：

$RN=T_2-C_{\left(1，2\right)}\cdot \left(T_1-{\bar{T}}_1\right)/V_1$

其中 $T_2$ 为施氮肥的性状， $C_{\left(1，2\right)}$ 为两种氮肥水平下的性状协方差， $T_1$ 为不施氮肥下的性状， ${\bar{T}}_1$ 为不施氮肥的性状平均值， $V_1$ 为不施氮肥的性状方差。除去基因型遗传背景后的密度效应就是氮肥响应。

2.5.3. QTL作图分析

应用IciMapping 4.0软件的完备区间作图法(ICIM-ADD)对各施氮肥水平下的表型数据进行加性QTL定位，LOD阈值设置为2.5；应用完备区间作图法(ICIM-EPI)进行上位性QTL定位，LOD阈值设置为5。对于达到显著水平的上位效应QTL和氮肥响应QTL，要求能够解释表型变异2%以上，才认为是有效的QTL。

按照q + “性状” + “染色体名称” + “顺序号”的方法命名QTL。用q代表QTL，PH代表株高，NN代表主茎节数，PNPP代表单株荚数，SNPP代表单株粒数，HSW代表百粒重，SWPP代表单株粒重，PC代表蛋白质含量，OC代表油分含量。

对于各性状的加性效应QTL，直接用数字编号。对于上位性QTL，应用“e + 数字”编号。对于氮肥响应QTL，应用“r + 数字”编号，在同一染色体上按照数字编号，在同一标记区间按照同一个顺序号编号。对于RIL3613和RIL6013两个群体进行统一编号。

3. 结果与分析

3.1. 表型变异分析

3.1.1. 方差与遗传率

从表2可以看出，两个重组自交系群体蛋白质含量与油分含量，在两个地点下氮肥施用量、基因型 × 氮肥互作效应、基因型效应都达到显著水平，说明这2个品质性状在基因型之间存在极显著差异，应用这两个群体进行遗传分析是可行的。从表3可以看出，在多个环境联合分析情况下，基因型、氮肥施用量、基因型 × 氮肥互作效应都达到极显著水平，并且地点间差异也是极显著的，说明基因型、氮肥施用量、基因型 × 氮肥互作效应在多种环境条件下都是存在的，并且其大小受到环境影响。综合多个地点单独分析和多个地点联合分析结果，可以得出在不同环境条件下，氮肥对各育种性状影响的遗传基础是不同的。

对于遗传率而言，在单个环境条件下，两个群体间同一性状在不同密度下，其遗传率差异非常大，说明两个群体各性状对于施肥量响应的遗传基础是不同的，因此通过两个群体育种性状的氮肥响应遗传分析，可以增加基因检测能力。各性状在不同地点之间，其遗传率也有较大差异，说明地点间基因型效应大小是不同的，基因型与氮肥的互作效应也是变化的。

Table 2. Analysis of variance and heritability of agronomic traits among different nitrogen fertilizers under different environmental conditions

表2. 不同环境条件下不同氮肥间品质性状的方差分析及遗传力

A) PC：蛋白质含量protein conten；OC：油分含量oil content；

B) E1：阿城；E2：双城；E3：哈尔滨；

C) N = 氮肥利用效应(Nitrogen utilization effects)；G = 基因型效应(Genotype effects)；GN = 氮肥 × 基因互作效应(Nitrogen × Genotype interaction effect)；

D) 广义遗传率Broad-sense heritability。

Table 3. Joint analysis of variance of Nitrogen, Genotype and Nitrogen × Genotype interaction effects for eight agronomic traits in two RILs

表3. 两个群体2个品质性状的氮肥、基因型和基因型 × 氮肥互作效应的3个环境联合方差分析

A) 地点L = Location effects；氮肥N = Nitrogen utilization effects；基因型G = Genotype effects；基因型 × 氮肥G × N = Nitrogen × Genotype interaction effect；

B) PC：蛋白质含量protein conten；OC：油分含量oil content。

3.1.2. 表型分离与次数分布

RIL3613和RIL6013两个群体的蛋白质含量、油分含量，在阿城、双城、哈尔滨等各亲本的表型性状值均落在后代群体的变异范围之内，说明各性状均存在超亲遗传(见表2，表3)。在氮肥施用和不施用情况下，各性状的平均数和标准差均有明显差异，说明氮肥影响每个群体各性状的表现。

在阿城、双城、哈尔滨等三个环境施氮肥与不施氮肥情况下，蛋白质含量在阿城施氮肥、双城不施氮肥、哈尔滨施氮肥环境下表现为偏态分布，在其他环境下表现为正态分布。油分含量在各环境下均表现为正态分布。

对于RIL6013群体，蛋白质含量在阿城施氮肥、不施氮肥、哈尔滨不施氮肥环境下表现为正态分布，而在其他三个环境下表现为偏态分布。油分含量在各环境下均表现为近似正态分布，但在哈尔滨不施氮肥环境下表现为偏态分布。

3.2. 大豆重要品质性状的加性QTL定位

3.2.1. 蛋白质含量加性QTL定位

在RIL3613和RIL6013群体中共检出4个控制蛋白质含量的加性QTL，分布在D1a、J、G、L连锁群，单个加性QTL可解释0.20~8.70%的表型变异(见表4)。qPC-D1a-1、qPC-J-1、qPC-G-1的正向加性效应来自东农L13，qPC-L-1的负向加性效应来自东农L13。qPC-J-1在两个环境下被重复检测到。

在RIL3613群体中，qPC-D1a-1所在的基因组区域已经定位了3个QTL (Seed protein 3-4、Seed protein 3-5、Seed protein 40-4)，qPC-L-1所在的基因组区域已经定位了2个QTL (Seed protein 36-31、Seed protein 2-2)。在RIL6013群体中，qPC-J-1所在的基因组区域已经定位了Seed protein 4-7，在qPC-G-1的基因组区域已经定位了7个QTL (Seed protein 34-9、Seed protein 41-3、Seed protein 28-2、Seed protein 3-8、Seed protein 3-9、Seed protein 1-8、Seed protein 3-10)。

Table 4. Additive QTL associated with protein content detected in two populations

表4. 两个群体中检测到的蛋白质含量加性QTL

A) LG：连锁群linkage group；

B) LOD：log of odd；

C) PVE：表型变异解释比率phenotypic variation explanation ratio；

D) Add：加性效应additive effects；

E) AC：阿城Acheng；SC：双城Shuangcheng；HRB：哈尔滨Harbin；

F) RIL3613：由东农L13 × 黑河36衍生的重组自交系群体recombinant inbred lines population derived from； Dongnong L13 × Heihe 36；RIL6013：由东农L13 × 合农60衍生的重组自交系群体recombinant inbred lines； population derived from Dongnong L13 × Henong 60。

3.2.2. 油分含量加性QTL定位

在RIL6013群体中共检出2个控制油分含量的加性QTL，分布在H、J连锁群，单个加性QTL可解释7.23%~7.50%的表型变异(见表5)。qOC-H-1、qOC-J-1的正向加性效应来自东农L13。

在以往的研究中，qOC-J-1所在区域定位到4个QTL(Seed oil 37-9、Seed oil 43-19、Seed oil 39-12、Seed oil 5-2)。qOC-H-1为本研究新发现的QTL。

Table 5. Additive QTL associated with oil content detected in two populations

表5. 两个群体中检测到的油分含量加性QTL

A) LG：连锁群linkage group；

B) LOD：log of odd；

C) PVE：表型变异解释比率phenotypic variation explanation ratio；

D) Add：加性效应additive effects；

E) AC：阿城Acheng；SC：双城Shuangcheng；HRB：哈尔滨Harbin；

F) RIL3613：由东农L13 × 黑河36衍生的重组自交系群体recombinant inbred lines population derived from； Dongnong L13 × Heihe 36；RIL6013：由东农L13 × 合农60衍生的重组自交系群体recombinant inbred lines； population derived from Dongnong L13 × Henong 60。

3.3. 大豆重要品质性状的上位性QTL定位

蛋白质含量上位性QTL定位

RIL3613群体和RIL6013群体在双城(E2)和哈尔滨(E3)两个环境的两种施氮肥条件下，共定位到4对蛋白质含量上位性QTL (见表6)，每对上位性QTL可解释4.04%~5.50%的表型变异，4对上位性QTL的上位效应均为正值。

Table 6. Epistatic effects QTL of additive × additive for protein content

表6. 蛋白质含量加性 × 加性上位互作效应QTL

在4对上位性QTL中，有3对上位性QTL在不施氮肥(N₋)处理下被检测到，1对上位性QTL在施氮肥(N₊)处理下被检测到。

2对上位性QTL由1个显著的加性QTL和1个不显著的加性QTL构成，其他2对由2个不显著的加性QTL构成。

在构成4对上位性QTL的5个加性QTL中，qPC-C2-e1、qPC-J-e1和qPC-J-e2是本研究新发现的。

3.4. 大豆重要品质性状氮肥响应的QTL分析

在RIL3613和RIL6013群体中，阿城和哈尔滨环境下检出2个蛋白质含量因施氮肥增加而变化的氮肥响应QTL，分布在J、G连锁群，单个氮肥响应QTL可解释8.88%~12.49%的表型变异。2个QTL的母本东农L13效应分别为负向和正向效应，均为本研究新发现的(见表7)。

3.5. 候选基因预测

使用两种类型的QTL进行候选基因注释，确定了2个与品质性状和产量性状相关的QTL区间，没有只与品质性状相关的QTL区间。基于使用SoyBase在线程序获得的标记信息，在4个一致QTL区间中，利用GO注释和KEGG数据库对1215个候选基因进行了筛选和注释，其中344、218、52、205个基因分别位于一致性QTL区域GM01、GM11、GM12、GM16内(见表8)。以下丰富在GO类别：GO:0006807 (氮化合物代谢过程)，GO:0034641 (细胞氮化合物代谢过程)，GO:0006886 (细胞内蛋白质运输)，GO:0008565 (蛋白质运输活动)，GO:0015031 (蛋白质运输)。在富集KEGG通路中，Ko04075参与植物激素信号转导途径 [12]，包括赤霉素、生长素、脱落酸等激素。植物激素在调节茎生长、植物生长和种子发育方面起着重要作用。其他丰富的KEGG通路包括K14484、K14493、K14496、K14486、K14488、K14498、K13946，参与植物激素信号转导(途径ID ko04075)。

Table 7. QTL for response of agronomic and quality traits to nitrogen change

表7. 大豆2个品质性状的氮肥响应QTL

Table 8. Consensue QTLs intervals and candidate genes distribution of related traits on four linkage groups

表8. 4个相关性状的一致性QTL区间的连锁群和候选基因分布

基于Pathway分析和功能注释，我们最终鉴定出15个候选基因(见表9)，其中Glyma.01G052800被注释为囊泡转运v-SNARE家族蛋白基因，在植物蛋白贮藏液泡的胞内囊泡转运过程中起作用 [13] [14]。Glyma.11G118600被标注为带有beta亚基和-2亚基基因的协同分子，在非饱和蛋白囊泡介导的细胞内生物合成蛋白运输中发挥作用，可能与蛋白质积累有关 [15]。在候选基因中，有3个被标注为saur样生长素应答蛋白家族基因，SAUR蛋白参与细胞分裂和生长素生物合成 [16]。Glyma0.01g004500、Glyma0.01g183500被标注为蔗糖非发酵相关蛋白激酶(SnRK)基因，这些基因与糖信号、生物和非生物应激反应、种子萌发、幼苗生长等方面密切相关 [17] [18]。

此外，SnRK2和SnRK3与脱落酸信号转导直接相关 [19]。Glyma0.01g019400被标注为吲哚-3-乙酸诱导基因，吲哚-3-乙酸是植物中普遍存在的内源生长素，如拟南芥 [20] 所示。Glyma11 g180900被标注为编码nitrilase 4，该酶可将吲哚-3-乙腈转化为生长素 [21]。08g203100被标注为编码一种与开花 [22] 相关的植物色素蛋白。将Glyma.01G103500标注为编码生长素响应因子，ARF9在果实发育早期表达，生长素 [23] 有应答。6个候选基因被标注为编码Adaptin家族蛋白或具有gamma亚基的Adaptin家族蛋白，这些基因参与了细胞内运输囊泡的形成，并参与了将货物纳入囊泡 [24] 的选择。01g179300被标注为网格蛋白重链，其作用是将高尔基体运输到液泡 [25]。g11g215500被标注为谷氨酰胺合成酶，是氮代谢 [26] 核心的高调控酶。16g082400被标注为Sec23/Sec24蛋白转运家族蛋白，Sec23亚基是连接COPII囊泡形成与顺行运输事件 [27] 的关键。最后，将Glyma.12G018500注释为s-1A，这是植物 [28] 中多种发育途径所必需的。

Table 9. Candidate genes annotated from consensue QTLs

表9. 一致性QTL注释的候选基因

4. 讨论

为突破重组自交系群体(RIL)中个体不易受环境的影响这一限制，本文所采用的三亲本联合分析群体为关联重组自交系群体(Associated Recombinant Inbred Line, A-RIL)，运用黑河36及合农60两个自交系群体分别与东农L13杂交所产生的重组自交系群体合并。在构建过程中由于两个重组自交系均含有共同亲本东农L13，因此能够突破以往研究中由于亲本单一所造成的限制，对于后代的多态性及变异率的增加有很多益处 [29]，同时由于连锁的不平衡性，对于该群体的联合连锁分析可以更好地评价较为复杂的性状遗传结构。

氮肥通过影响干物质的积累和分配进而对大豆品质产生影响。郭庆元等 [30] 学者认为施用氮肥量对大豆产量及品质有着很大影响，产生这种影响的因素主要有三个，一是土壤肥力，二是大豆品种，三是施肥比例，这是基于早期研究结果得出的结论。谷秋荣等学者 [31] 认为，提高大豆脂肪含量和粗蛋白含量，需要通过施用铵态氮才能达到最好的效果。此外还有研究表明，增加叶面积指数和干物质积累 [32] [33] [34] 可以提高大豆产量，这是通过增施基肥氮达到的增产效果，增施基肥氮也可以保持更大的叶片面积，同时延缓叶片衰老，还可以促进氮素向籽粒分配 [35]，并促进大豆植株各部分干物质的输出 [36]。丁洪等学者认为不同大豆品种对于氮肥的反应有所不同，高蛋白大豆品种对氮肥的反应要优于低蛋白品种 [37]。王雪依等学者认为，对于早熟及晚熟品种来说增施氮肥可以提高大豆产量，对于中熟品种来说，增施氮肥可以提高大豆蛋白质含量，但却造成了减产，对于晚熟品种来说，增施氮肥可以提高大豆油分含量 [38]。刘波等学者认为在关键生育时期施用氮肥可以提升大豆品质，对大豆籽粒脂肪含量的提高起着关键作用，在大豆分枝末期施用氮肥，可以促进大豆籽粒脂肪含量的提高 [39]。赵小铭等学者认为显著提高大豆油分含量需要施用配制比例合理的氮磷钾肥 [40]。宁海龙等学者认为提高大豆蛋白质含量需要施用配制比例合理的氮磷钾肥 [11]。姜璐等研究结果表明，随着施氮量的增加，大豆产量和蛋白质含量均有提高，而大豆油分含量却有所下降。综合以上研究可以得出，通过调整氮肥施用量可以促进大豆产蛋白质含量的提高。

本研究应用两个重组自交系群体RIL3613和RIL6013的290份材料，分别在磷肥和钾肥正常施用条件下，设置不施用氮肥(N₋)和施用氮肥下(N₊)处理，发现在施用氮肥下(N₊)的蛋白质含量高于不施用氮肥(N₋)，油分含量变化不大，说明施用氮肥下，可提高节间长度，提升蛋白质含量。从群体各性状的表型变异可以得出，两个重组自交系群体RIL3613和RIL6013的蛋白质含量与油分含量这2个品质性状在各地点环境下，基因型 × 氮肥互作效应达到显著水平，并且从不同氮肥处理下的分布和变异幅度可以得出，2个品质性状对于氮肥变化的响应在基因型之间存在显著差异，氮肥对各育种性状影响的遗传基础是不同的。

本研究在正常使用氮肥(N₊)和不施氮肥(N₋)条件下进行2个品质性状的QTL定位，在正常使用氮肥条件下定位到45个QTL，在氮胁迫条件下定位到52个QTL，在两个环境下同时定位的QTL有8个，包括qPH-D1b-e1、qPH-B1-1、qSN-N-e1、qPH-F-1、qPC-J-1、qPH-D1a-e1、qPH-D1a-1、qPH-F-e2。综合本研究和以往研究结果可以得出，在不同氮肥下的特异性QTL数量多于多环境通用QTL的数量，因此选育适合多种施肥水平的大豆品种比较困难，选育适合某一氮肥水平的大豆品种相对容易，在不施氮肥条件下定位的QTL更适用于低氮胁迫的品种改良。

应用连锁分析，在15个区域定位了15个氮肥响应QTL，包括4个株高、4个主茎节数、2个单株荚数、1个单株粒数、2个单株粒重、2个蛋白质含量的氮肥响应QTL。这些QTL中有9个QTL在不施氮肥条件下被检测到，2个QTL在施氮肥和不施氮肥条件下被同时检测到，说明这些QTL控制着氮肥的累积效应。