基于整合药理学的乳酸改善小鼠焦虑作用及机制研究

Research on the Effect and Mechanism of Lactic Acid on Improving Anxiety in Mice Based on Integrated Pharmacology

摘要: 目的：基于网络药理学方法探究乳酸改善焦虑的主要靶点及信号通路,结合行为学初步研究其潜在作用机制方法：通过Swiss Target Prediction、Target Net、Sea数据库获得乳酸作用靶点；通过Gene Cards、OMIM、CTD数据库获得焦虑靶点；通过Gene Cards和OMIM建立乳酸和焦虑症的靶基因集用韦恩图显示；通过STRING数据库构建乳酸与焦虑蛋白互作PPI网络图，利用DAVID数据库进行GO功能富集与KEGG通路富集分析。基于网络药理学预测的通路结果，将雄性ICR小鼠随机成溶媒组、乳酸组，每组10只，进行旷场实验，在实验前1 h腹腔注射乳酸或溶媒，记录在旷场实验中进入中间区域的时间和活动度并计算辨别指数。结果：通过Swiss Target Prediction、Target Net、Sea数据库共获得乳酸作用靶点248个；通过Gene Cards、OMIM、CTD数据库共获得焦虑靶点717个；靶点经与Gene Cards和OMIM综合数据库比对，共获取28个乳酸与焦虑的交集基因。结论：乳酸主要通过调控MAO-A信号通路进一步调节5-HT代谢，以及调控苯丙氨酸和酪氨酸代谢与cAMP信号通路及相应的基因表达进一步调节儿茶酚胺类神经递质代谢发挥抗焦虑作用。

Abstract: Objective: To explore the main targets and signal pathways of lactic acid for improving anxiety based on the method of network pharmacology, and to study its potential mechanism of action in combination with behavioral studies. Methods: Obtain lactic acid targets through Swiss Target Prediction, Target Net, and Sea databases; obtain anxiety targets through Gene Cards, OMIM, and CTD databases; establish lactic acid and anxiety target gene sets through Gene Cards and OMIM; display with Venn diagram; construct lactic acid through STRING database. It interacts with anxiety protein as a PPI network diagram, and uses DAVID database for GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis. Based on the results of network pharmacology, Male ICR mice were randomly divided into a vehicle group and a lactic acid group, each with 10 mice, and an open field experiment was performed. Lactic acid or vehicle was injected into the abdominal cavity 1 hour before the experiment and the time and activity of entering the middle area in the open field experiment were recorded and the discrimination was calculated. Index. Results: A total of 248 lactic acid targets were obtained through Swiss Target Prediction, Target Net, and Sea databases; a total of 717 anxiety targets were obtained through Gene Cards, OMIM, and CTD databases; a total of 28 lactic acid targets were obtained by comparison with Gene Cards and OMIM comprehensive databases. The intersection gene with anxiety. Conclusion: Lactic acid mainly regulates 5-HT metabolism by regulating the MAO-A signaling pathway, as well as regulating the metabolism of phenylalanine and tyrosine, the cAMP signaling pathway and the corresponding gene expression to further regulate the metabolism of catecholamine neurotransmitters to exert anti-anxiety effects.

1. 引言

焦虑症(anxiety disorder)是一种精神性疾病，随着社会的发展，人类生活节奏加快，焦虑症的发病率逐年升高，焦虑症的临床表现主要为无明确客观事物的紧张、恐惧、不安等，伴有自主神经紊乱、肌肉紧张、运动不安等症状 [1] [2]。焦虑症的发病机制尚未明了，现代医学研究较为认可的有神经递质假说、内分泌功能紊乱假说以及免疫功能紊乱假说 [3] [4]。临床中常用的抗焦虑药物有停药反应、赖药性、患者依从性差、依赖性等不良反应 [5]，已不能满足焦虑症患者的需求。因此，寻找有效、不良反应小的新型抗焦虑或缓解焦虑症状药物亟需解决。

乳酸(lactic acid)是哺乳动物体内最常见的代谢物之一 [6]。最新的研究表明乳酸不仅是作为能量底物，还可以作为信号分子 [7] [8]。在大脑中，乳酸主要在星形胶质细胞中产生乳酸生成后可通过星形胶质细胞膜上的单羧酸基转运体1 (Monocarboxyl transporter 1, MCT1)与4(Monocarboxyl transporter 4, MCT4)转运出星形胶质细胞，释放至胞外的乳酸既可作为能量底还能发挥信号分子参与中枢系统多种生理过程 [9] [10]。研究证实腹腔注射乳酸有显著的抗抑郁作用，此外，产生乳酸的肠道益生菌有改善焦虑样行为的作用 [11]。外周给予乳酸是否能改善焦虑尚需进一步研究。

2. 材料与方法

2.1. 网络药理学

2.1.1. 查找化合物靶点

通过采集化合物作用靶点，探究化合物-靶点相互作用关系从而研究药物的潜在作用机制。首先登录Pub Chem Compound (网址：http://en.chembase.cn/company-17.html)数据库 [12] 采集化合物的CAS号，然后将CAS号上传到Swiss Target Prediction (网址：http://www.swisstargetprediction.ch/)、Target Net (网址：http://targetnet.scbdd.com)数据库 [13] [14] [15] 并设置物种为人类检索其靶点，将所有靶点名称整合为该靶点的基因名称，将结果保存至我的电脑，用于后续的其它分析工作。

2.1.2. 查找焦虑症相关靶蛋白

Gene Cards (网址：https://www.genecards.org/)、OMIM (网址：https://www.omim.org/)等数据库 [16] [17] 提供了人类目前已知的所有基因的详细信息，包括基因组、转录组、蛋白质组、遗传学、临床和功能信息，来自以基因为中心的数百个数据源。在Gene Cards、OMIM [18] 数据库中输入“Anxiety”关键词并限定物种为人类检索与焦虑相关的靶点基因，将所得结果下载至我的电脑，用于后续的其它分析工作。

2.1.3. 构建药物与疾病靶点基因交集

登录Venny 2.1.0网站，将下载好的药物靶点与疾病靶点基因导入得到相应的交集基因，将所得的Venny图与交集基因保存用于后续分析工作。

2.1.4. 蛋白质相互关系网络的构建

STRING (网址：https://string-db.org/)数据库 [19] 是一个检索已知的蛋白互作关系在线数据库。将乳酸与焦虑症的交集靶点基因导入STRING数据库数据库并设置物种为人类，将同步获取乳酸焦虑症的交集靶点基因调控的蛋白之间的相互作用关系，将结果下载至我的电脑，之后将node1，node2和Combined score信息导入Cytoscape进行可视化处理，利用Network analyzer数据分析，最后可根据Degree的大小筛选出核心靶点，以及获得乳酸作用靶点的蛋白相互作用网络图。

2.1.5. 基因功能和信号通路分析

生物学信息注释数据库(David网址：https://david.ncifcrf.gov/) [20] 为基因和蛋白提供系统综合的生物功能注释信息，可以进行GO功能分析记忆KEGG通路富集分析。GO功能分析主要用于描述基因产物的功能，包括细胞、分子、生物等功能，KEGG富集分析用于探究药物的潜在靶点可能具有的生物学功能及参与的生物学通路 [21]。首先将乳酸与焦虑症交集靶点基因导入David数据库，Select Identifier设置为OFFICIAL_GENE_SYMBOL, List Type设置为Gene List，物种设定为物种为人，将所得结果进行Gene Ontology和Pathway分析，用GraphPad Prism 5.0绘图，保存结果。

2.2. 实验动物

雄性ICR小鼠(7周龄)购于中国湖南长沙的湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠饲养在恒温23℃ ± 2℃的笼子中(每个笼子1只小鼠)，并在12小时的明暗交替环境中自由进食和饮水。实验开始前一周，实验者每天对小鼠进行抚摸(5 min/只) [22]。所有实验程序均按照美国国立卫生研究院关于和使用实验动物指南进行。

2.3. 旷场实验

旷场实验可以评估小鼠运动活动和焦虑样行为，旷场实验装置由带有暗光(25 lx)和通风扇(30 dB)的木质隔音箱(50 cm × 50 cm × 70 cm)和置于隔音箱中心上方的数码相机组成，隔音箱覆盖黑色薄膜，用白色标记笔画出中间区域(30 cm × 30 cm)。实验时将小鼠放置于箱子中自由探索10分钟然后放回鼠笼，每次实验后，喷洒75%的酒精用抹布擦拭装置去除遗留的气味，用ANYmaze统计进入中间区域的时间以及总活动度。

2.4. 药物

将乳酸钠(厂商)溶解在生理盐水中，该生理盐水也用作溶媒。本研究中使用的乳酸(1 g/kg)的剂量是根据以前的研究选择的。每只小鼠以10 ml/kg的体积腹腔给药。

2.5. 统计分析

统计分析均使用Sigma Stat 3.1完成，实验数据均采用单向方差分析(one-way ANOVA)和非配对的t检验，所有数据均表示为平均值 ± 标准误。

3. 结果

3.1. 靶点筛选

通过Swiss Target Prediction、Target Net数据库获得乳酸作用靶点共有248个，通过Gene Cards、OMIM数据库获得焦虑靶点共有717个，通过与Gene Cards和OMIM数据库中乳酸与焦虑症相关的基因进行比对，得到28个可能与乳酸改善焦虑相关的作用靶点。登录Venny 2.1.0网站，将采集的药物靶点与疾病靶点基因导入得到相应的交集基因，导出Venny图(图1)。

Figure 1. Venn diagram of the intersection gene of lactic acid and anxiety

图1. 乳酸与焦虑交集基因的韦恩图

3.2. 蛋白质互作网络构建与分析

将乳酸与焦虑症交集靶点基因名导入STRING数据库，物种限定为人类，分析蛋白相互作用关系，得到乳酸与焦虑症交集基因靶点的蛋白互作网络图(图2(A))，该网络图含有28个节点和79条边线，不同节点分别代表不同的靶点蛋白，不同颜色的连线表示各节点之间的相互作用关系，将结果导入Cytoscape软件绘制乳酸与焦虑症交集基因核心靶点蛋白相互作用网络图(图2(B))以及核心靶点(表1，Degree > 7)，节点大小，字号大小与Degree呈正相关。

(A) (B)

Figure 2. Diagram of the interaction relationship between lactic acid and anxiety intersection gene target protein

图2. 乳酸与焦虑交集基因靶点蛋白相互作用关系图

Table 1. Core targets of intersection genes of lactic acid and anxiety

表1. 乳酸与焦虑交集基因核心靶点

3.3. GO富集分析

利用David数据库进行GO功能富集分析，对乳酸改善焦虑症涉及的28交集基因的功能作用进行了分析(图3)。主要涉及多巴胺能传递、神经系统过程、突触传递、代谢过程，信号调节等方面；分子功能结果主要包括配体激活的转录因子活性，核受体活性，类固醇羟化酶活性，氧化还原酶活性，单加氧酶活性，神经递质受体活性，血红素结合等，细胞组成主要结果有突触膜区、膜微区、膜筏，神经元棘突、树突棘等方面。

Figure 3. GO enrichment of the intersection gene of lactic acid and anxiety

图3. 乳酸与焦虑交集基因GO富集

3.4. KEGG富集分析

利用DAVID数据库对乳酸与焦虑症的交集基因进KEGG通路富集分析(图4)，共获得条富集结果共20条，其中主要包括环磷腺苷信号通路，钙信号通路等信号传导相关通路，涉及成瘾，帕金森综合症，神经退行性疾病通路，内分泌抵抗等生物系统相关通路，以及药物代谢–细胞色素p450，色氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、亚油酸、酪氨酸代谢。此外还包括多巴胺能突触，血清素突触。

3.5. 实验前1 h腹腔注射乳酸对旷场实验的影响

如图所示，各组之间的总活动度没有显著性(P > 0.05；图5(A))。尿刊酸组进入中间区域的总时间(P > 0.05；图5(B))有显著性差异，上述结果表明，乳酸改善了旷场实验中小鼠的焦虑症状。

4. 讨论

通过网络药理学，本研究对乳酸改善焦虑的主要靶点及信号通路进行了预测，本研究结果显示，乳酸与焦虑症交集靶点基因共有28个，通过STRING数据绘制蛋白互作网络图，直观地展现了乳酸与焦虑的多重机制与相互关联。对酸与焦虑症交集靶点基因进行生物信息富集分析的结果显示，乳酸改善焦虑可能与巴胺能传递、神经系统过程、突触传递、代谢过程，信号调节，受体及酶活性等方面密切相关。

Figure 4. KEGG enrichment of lactic acid and anxiety intersection genes

图4. 乳酸与焦虑交集基因KEGG富集

Figure 5. Lactic acid injection 1 h before the test in the open field experiment can improve anxiety. (A) The total time for each group of mice to enter the middle area in the open field test. (B) Mobility of each group of mice in the open field test. ^*P < 0.05 compared with vehicle group

图5. 在旷场实验中测试前1 h注射乳酸可以改善焦虑。(A) 各组小鼠旷场测试中进入中间区域总时间。(B) 各组小鼠旷场测试中活动度。^*P < 0.05与溶媒组相比

研究表明，焦虑症的发病与突触间隙神经递质浓度的改变密切相关，5-HT，多巴胺，去甲肾上腺素，γ-氨基丁酸，神经肽Y，谷氨酸等含量变化与焦虑症的发生发展密切相关当各种原因导致神经递质浓度异常、递质传递功能紊乱时，个体将会表现出焦虑样症状 [2] [23] [24]。相关研究结果表明，5-HT主要受MAO-A调节，MAO-A浓度的变化会间接影响大脑的5-HT代谢，从而导致焦虑样行为 [25]。本研究的靶点预测中，乳酸与焦虑症交集靶点基因的蛋白互作网络图存在MAO-A，MAO-B等靶点，与现有研究报道一致，表明乳酸可能通过该靶点改善焦虑。

研究表明，多巴胺激动杏仁核中的D1，D2受体，可以抑制腺苷酸环化酶(AC)活性，使环磷腺苷(cAMP)减少，进一步抑制蛋白激酶A (PKA)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)活性，从而参与焦虑调节 [26] [27]，然而在儿茶酚胺类神经递质的合成过程中，苯丙氨酸和酪氨酸在酶的作用下产生多巴胺。在本研究的KEGG富集中存在苯丙氨酸和酪氨酸代谢，多巴胺突触以及cAMP信号通路与之前的焦虑症发病机制高度符合，提示乳酸通过该类通路改善焦虑。

本研究通过旷场测试来评价乳酸的抗焦虑作用，研究发现乳酸组与相比，乳酸在旷场实验中能明显改善小鼠的焦虑行为。结合网络药理学与行为学测试的结果，乳酸可能通过调节单胺类神经递质的代谢发挥抗焦虑作用，主要通过乳酸主要通过调控MAO-A信号通路进一步调节5-HT代谢，以及调控苯丙氨酸和酪氨酸代谢与cAMP信号通路及相应的基因表达进一步调节儿茶酚胺类神经递质代谢发挥抗焦虑作用。本研究通过网络药理学进行通路预测与行为学实验验证了乳酸改善焦虑的作用，为乳酸改善焦虑分子机制的进一步研究奠定了基础。

基金项目

省级大学生创新创业训练计划项目(编号：S202010547016)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。