1. 引言
气滞胃痛颗粒主要是由柴胡、炙甘草、白芍、枳壳、香附(炙)、延胡索(炙)组成的，该品种被《中国药典》收载为非处方药，此药广泛用于治疗肝郁气滞、胸痞胀满、胃脘疼痛等，疗效确切，有抗炎镇痛、抗溃疡、促胃动力等作用 [1] [2] [3]。
气滞胃痛颗粒以芍药苷为定量指标 [4]，主要存在于白芍中。白芍为毛莨科植物芍药的干燥根，具有养血护经、柔肝止痛、缓急舒挛等功能，主要用于治疗胁痛、腹痛、四肢挛痛、头痛眩晕等。芍药苷是一种单萜类糖苷化合物，于1963年首次从毛莨科植物芍药中提取，是芍药根中糖苷类物质白芍总苷的主要活性成分 [5] [6]，具有抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、免疫调节及补血等作用，且毒副作用较小，其药用价值受到社会广泛关注，故芍药苷在线快速检测具有很大的应用空间。喷雾制粒是将药物溶液或混悬液用雾化方式喷雾于干燥室内的热气流中，使水分迅速蒸发以直接制成球状干燥颗粒的方法 [7]。气滞胃痛颗粒采用沸腾式一步制粒机制粒干燥，在喷入清膏的同时进行干燥，在此过程中，操作人员通常经过肉眼与经验观察颗粒状态，从而调节进风温度、供液压力及风机频率等工艺参数，其方法具有误差大、效率低等缺点。
根据现代近红外光谱(NIR)理论，每种物质对电磁波都有吸收能力，但这种吸收是有波长选择性的 [8]。本研究采用在线近红外光谱检测技术，在沸腾式一步制粒机基础上进行改造，联合化学计量学方法(偏最小二乘法)，对气滞胃痛颗粒一步制粒过程中芍药苷含量指标建立定量模型，精准地监控了一步制粒过程的质量变化，保证其过程质量稳定，为气滞胃痛颗粒生产指导提供了一定科学依据。
2. 实验部分
2.1. 仪器与试剂
气滞胃痛颗粒(华润三九(本溪)药业有限公司)；MicroNIR光谱仪(美国VIAVI)；高效液相色谱仪(Agilent 1260)；超声波清洗仪(KQ-500DE)；QUINTIX224-1CN型电子天平(赛多利斯)；XP56型电子天平(梅特勒–托利多公司)。
甲醇为分析纯；水为超纯水；乙腈为色谱纯；磷酸色谱纯。
2.2. 在线近红外光谱采集
基于FL-300C沸腾式一步制粒机视窗改造，通过蓝宝石视窗对沸腾式一步制粒机内气滞胃痛颗粒制粒全过程进行光谱扫描。光谱采集条件：扫描范围为908~1675 nm，扫描次数为100次，积分时间10.3 ms。气滞胃痛颗粒原始光谱如图1所示。
Figure 1. Near infrared original spectroscopy of Qizhiweitong granules
图1. 气滞胃痛颗粒近红外原始光谱
2.3. 气滞胃痛颗粒半成品中芍药苷含量的测定
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以乙腈为流动相A；以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱，检测波长为230 nm [9]。
Table 1. Gradient conditions of liquid chromatography at different times
表1. 不同时间液相色谱梯度条件
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加乙醇制成每l ml含80 ug的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50 ml，密塞，称定重量，室温下超声处理(功率250 W，频率50 kHz) 60分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 ul，注入液相色谱仪，测定。
2.4. 数据处理与模型性能评价
采集近红外光谱图后，运用Bruker公司OPUS 7.8数据分析软件中的偏最小二乘法建立气滞胃痛颗粒半成品芍药苷的近红外光谱与含量之间的校正模型。建立模型前，需要筛选出原始光谱中适宜的波段建立模型，这样能够快速提取光谱中的有效信息，缩短建模时间，减少计算量。由于仪器背景或环境会对近红外光谱产生一定影响，还需要对样品光谱进行平滑、微分等适宜的光谱预处理。
运用留一交叉验证法(Leave-One-Out Cross Validation, LOOCV)，以交互验证误差均方根(Root Mean Square Error of Cross Validation, RMSECV)为指标，表征NIR结果与参照结果差异的标准误差 [10]，通过预测残差平方和作为判别依据来确定最佳因子数。对校正集样本和验证集样本的预测误差分别用校正集误差均方根(RMSEC)、验证集误差均方根(RMSEP)、校正集相对偏差(RSEC)和验证集相对偏差(RSEP)考察。以模型相关系数(Correlation Coefficient, R)来判断模型性能的好坏。Williams等 [11] 提出用相对分析误差[ratio of (standard error of) prediction (validation) to (standard) deviation, RPD]，来表现模型的是好坏。建立的模型相关系数(R)越接近1，说明样品实测值与通过模型得到的预测值之间越接近，进一步证明建立的校正模型稳定性好，预测能力强。当RMSEC和RMSEP值越小且彼此接近(一般在10%以内)，表明模型具有好的稳健性。RSEC和RSEP亦是评价模型性能的重要指标，RSEC和RSEP值越小且彼此接近，说明模型的稳健性良好并且对未知样品的预测能力较强。
3. 结果与讨论
3.1. 气滞胃痛颗粒半成品有效成分含量测定结果
按照2.3项下的方法测定199个气滞胃痛颗粒半成品样品中芍药苷的含量，芍药苷含量的范围4.5~13.4 mg/g之间。故有必要在气滞胃痛颗粒半成品投入生产变成成品前对其芍药苷含量进行快速测定，从而筛选出合格的气滞胃痛颗粒半成品投入大生产，保证气滞胃痛颗粒制剂的安全、有效。
3.2. 光谱预处理
近红外光谱采集过程中，外部环境、颗粒本身温度、沸腾颗粒间隙以及仪器性能的改变都会导致光谱基线漂移，进而干扰校正结果，因此在建模前需要对原始光谱进行光谱预处理以提高模型预测精度。OPUS数据分析软件中常用的光谱预处理方法有：一阶导数(1st)、二阶导数(2nd)、多元散射校正(MSC)、消除常数偏移量、矢量归一化(SNV)等。根据应用目的，恰当的选择评价参数和评价方法 [12]，本研究比较了不同预处理方法对气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量建模的影响，结果如表2所示。
Table 2. Effects of different pretreatment methods on paeoniflorin content model of semi-finished Qizhi Weitong granules
表2. 不同预处理方法对气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量模型的影响
通过比较发现，气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量在908.10~1372.70、1440.81~1527.54、1595.67~1676.20 nm的波段范围内，通过一阶导数 + MSC处理后得到的模型有较低的RMSEP值和较高的RPD值，且相关系数R值更接近1。
3.3. 定量模型的建立
经过异常点判断、光谱预处理以及建模波段选择的步骤后，最终得到由PLS法所建立的，气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量近红外定量校正模型(其中校正集样本131个，验证集样本59个)。获得气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量模型的校正集样品实测值和NIR预测值的相关关系，如图2所示。模型的参数汇总见表3。
Figure 2. Correlation between HPLC measured value and NIR predicted value of paeoniflorin content in semi-finished products of Qizhiweitong granules
图2. 气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量HPLC实测值和NIR预测值相关性图
Table 3. Summary of model parameters of paeoniflorin content in semi-finished products of Qizhiweitong granules
表3. 气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量模型参数汇总
从表3可以看出，采用一阶导数 + MSC处理方式，在波段908.10~1372.70、1440.81~1527.54、1595.67~1676.20 nm内采用偏最小二乘法所建立的气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量近红外定量分析校正模型效果最佳。其中，模型校正集实测值与NIR预测值的相关系数为0.9542，RPD为3.29，RMSEP为0.697。
3.4. 定量模型的验证
为了进一步验证模型的预测能力，本研究根据3.3中所建立的模型来预测验证集样本。芍药苷含量的NIR预测值和HPLC法测得值的比较如图3所示，模型预测参数汇总见表4。
Figure 3. Comparison between HPLC measured values and NIR predicted values of extract content in Radix Isatidis
图3. HPLC实测值和NIR预测值比较
Table 4. Prediction effect parameters of paeoniflorin content model of semi-finished Qizhiweitong granules
表4. 气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量模型的预测效果参数表
从图3可以直观地看出NIR定量校正模型的预测值与实际测得芍药苷含量之间的相关性。表3结果显示芍药苷含量模型的RMSEP值小于0.7，RSEP (%)小于10%，说明近红外光谱分析方法基本可以较好地预测气滞胃痛颗粒半成品芍药苷的含量。
4. 结论
本研究建立了气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量的近红外快速分析方法，所用的芍药苷含量的数据由苏州泽达兴邦医药科技有限公司实验室测定。应用PLS建立的浸出物含量的定量校正模型，其相关系数R为0.9542，RMSEP为0.697，RSEP (%)为6.95，满足定量分析的要求。所建立的近红外模型能够在较短的时间内通过采集近红外光谱对气滞胃痛颗粒半成品芍药苷含量进行测定，相较于传统方法(液相、紫外等)具有简便、快速、无损的优点。
基金项目
项目名称：2019年辽宁省重点研发计划项目《气滞胃痛颗粒智能制造技术研究与产业化应用》(2019JH2/10100002)。