1. 引言
目前，肥胖成为困扰人类的一大难题。中国人的饮食习惯，容易淀粉摄入过多增加肥胖风险，而淀粉酶抑制剂在控制人体血糖及淀粉类食物的消化性吸收方面应用广泛 [1] [2] [3]。特别是白芸豆的α-淀粉酶抑制剂在餐前服用相应剂量可产生一定的减肥功效已经得到临床研究的证实 [1] [2] [3]。因此，“白芸豆阻糖”变成“网红药”，被添加至网络销售的食品中。但是，日常检验过程中，这些网红阻糖食品，通常产品类型为紧实型压片糖果。一些减肥类、降血脂类和润肠通便类食品在功能宣称可以“抗糖”，但与产品原料功能不符。网售阻糖食品作为一种新生事物，监管体系不健全，也未建立对其阻糖有效性的检测方法。针对网红抗糖食品阻糖有效性分析检测方法的缺失和标准落后的情况，本文初步研究能测试阻糖食品有效性的检测方法。并采用该方法对网络销售的25种配料表中有标注添加白芸豆水解蛋白的网红抗糖、阻糖食品进行检测，以期为食品监管及规范网络市场提供技术支撑。
2. 材料与方法
2.1. 材料与仪器
磷酸二氢钾(临安青山化工试剂厂、99.5%)；可溶性淀粉(麦克林、AR99。0%)；碘(中国湖州化学试剂厂、99.8%)；碘化钾(麦克林、99.0%)；芸豆α-淀粉酶抑制剂(云南天保桦生物资源开发有限公司)；Tris饱和酚(上海源叶生物科技有限公司、PH > 7.8)；
国药集团化学试剂有限公司：三氯甲烷(≥99.0%)；冰乙酸(≥99.8%)；无水乙醇(≥99.7%)；异戊醇(≥98.5%)；异丙醇(≥99.7%)；氢氧化钠(97.0%~100.5%)；盐酸(36.0%~38.0%)；三水乙酸钠(≥99.0%)；琼脂糖(电泳纯)；三-(羟甲基)氨基甲烷(99.8%~100.2%)；二水乙二胺四乙酸二钠盐(≥99.0%)；氯化镁(98.0%)；乙醇(99.7%)；
上海麦克林生化科技有限公司：可溶性淀粉(99.0%)；无水亚硫酸钠(98.0%)；酒石酸钾钠(99.5%)；
上海阿拉丁生化科技股份有限公司：蔗糖(99.0%)；3,5-二硝基水杨酸(99.0%)；苯酚(99.0%)；阿尔法淀粉酶(阿拉丁、BR)。
双光束紫外可见分光光度计(岛津仪器有限公司、UV-2700i)；
ABI荧光定量PCR仪(美国Thermo Fishe、rViiA7)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 试样制备
将芸豆α-淀粉酶抑制剂和网购的25种配料表中有标注添加白芸豆水解蛋白的网红抗糖、阻糖食品标号为2~26样品，纯芸豆α-淀粉酶抑制剂样品标为1号。适量称取每种样品，碾碎制粉，准确称取试样粉末1 g (精确至 0.0001 g)溶于去离子水中，并定容至100 mL制成待测液。
2.2.2. 碘比色法测定抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果
分别移取 0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、1.00 mL浓度为1.00 mg/mL用磷酸盐缓冲液(pH 6.0)配制的α-淀粉酶溶液，加入0.25 mL试样，37℃反应30 min。加入1%可溶性淀粉溶液1 mL，37℃恒温反应15 min后加碘显色，上述比色原液加水至5.00 mL，摇匀，于660 nm处测定吸光度值。空白管不加样品和淀粉酶，对照管不加样品。根据吸光度的差异计算样品的相对抑制效果，两次平行试验相对偏差小于3.0%，取算术平均值为分析结果 [4]。
2.2.3. Bernfeld法测定抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果
分别移取0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、1.0 mL浓度为1mg/mL用磷酸盐缓冲液(pH 6.0)配制的α-淀粉酶储备液，加入100 μL浓度为10.0 g/L的可溶性淀粉，37℃反应5 min。反应完成后加入500 μL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)，加入0.25 mL试样，沸水浴10 min，取出反应液冷却15 min，上述比色原液加水至5 mL，摇匀，在546 nm处测定吸光度值。空白管不加样品和淀粉酶，对照管不加样品。根据吸光度的差异计算样品的相对抑制效果，两次平行试验相对偏差小于3.0%，取算术平均值为分析结果。
2.2.4. PCR法测定抗糖食品中芸豆成分
参考GB/T 23814-2009莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法 [5]，对上述试验中抑制比为“0”的6号、7号、10号、14号、17号、19号、25号等共计7个抗糖样品进行芸豆成分检测。
3. 实验结果
3.1. 碘比色法测定抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果
由表1可以看出，1号芸豆α-淀粉酶抑制剂随着α-淀粉酶浓度的增加抑制效果减弱 [6]，18种有抑制效果的阻糖食品也有相同趋势，这与抑制剂吸附的抑制原理相一致 [7]。碘比色法测定抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果，在α-淀粉酶浓度0.10 mg/mL至0.20 mg/mL时，已经能较好区分阻糖食品的抑制效果，但在α-淀粉酶浓度0.01 mg/mL至0.05 mg/mL时，无法区分阻糖食品的抑制效果。
Table 1. Determination of 25 kinds of anti sugar foods by iodine colorimetry α-Inhibitory effect of amylase activity
表1. 碘比色法测定25种抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果
3.2. Bernfeld法测定抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果
由表2可以看出，1号芸豆α-淀粉酶抑制剂随着α-淀粉酶浓度的增加抑制效果减弱 [6]，13种有抑制效果的阻糖食品也有相同趋势，5种阻糖食品在α-淀粉酶浓度0.15 mg/mL至0.20 mg/mL时，随着α-淀粉酶浓度的增加抑制效果增强，这5种阻糖食品的配料表中均添加其他功能性成分 [8]。Bernfeld法测定抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果，在α-淀粉酶浓度0.01 mg/mL至0.10 mg/mL时，已经能更好区分阻糖食品的抑制效果，但当α-淀粉酶浓度达到0.15 mg/mL至0.20 mg/mL时，无法区分阻糖食品的抑制效果。
Table 2. Determination of 25 kinds of anti sugar foods by Bernfeld α-inhibitory effect of amylase activity
表2. Bernfeld法测定25种抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果
3.3. PCR法测定抗糖食品中芸豆成分
上述表格中抑制比为“0”的7种抗糖食品中，均未检出芸豆成分。
4. 结果与讨论
4.1. 两种检测方法的比较
碘比色法测定抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果，在α-淀粉酶浓度0.10 mg/mL至0.20 mg/mL时，能较好区分阻糖食品的抑制效果 [9] [10]。在18种阻糖食品中，对浓度0.20 mg/mL抑制比达到50%及以上的有8种。这8种阻糖食品配料表中，有的标注白芸豆提取物含量在25%以上，有的添加酒糟发酵精华、匙羮藤精华、藤黄果精华、绿咖啡提取物、软猕猴桃提取物、膳食纤维、针叶樱桃果粉、菊粉等抑制糖分的添加剂 [11] [12] [13] [14]。
Bernfeld法测定抗糖食品对α-淀粉酶活力的抑制效果，在α-淀粉酶浓度0.01 mg/mL至0.10 mg/mL时，能更灵敏的区分阻糖食品的抑制效果，但当α-淀粉酶浓度达到0.15 mg/mL至0.20 mg/mL时，无法区分阻糖食品的抑制效果，特别是无法区分复合抗糖食品的抑制效果 [15]。
由图1可以看出，当α-淀粉酶浓度为0.10 mg/mL时，碘比色法和Bernfeld法既能区分不同试样的区分阻糖食品的抑制效果，又能让方法选择对测试结果的影响减至最小。人体肠道、胃和血清中的总淀粉酶含量在8.3 × 102~6.3 × 104 C/g之间 [10] [16] [17] [18]，食物中的淀粉酶含量在0.1~50 μg/mL之间 [19] [20]，均包含在试验中α-淀粉酶最佳检测浓度。
Figure 1. Two test methods for different concentrations α-Comparison of inhibitory effects of amylase activity
图1. 两种测试方法对不同浓度α-淀粉酶活力的抑制效果影响的比较
4.2. 结论
本文采用碘比色法和Bernfeld法对网络销售的25种配料表中均标注添加白芸豆水解蛋白的网红抗糖、阻糖食品进行检测。通过对α-淀粉酶浓度的梯度筛选，确定当α-淀粉酶浓度为0.10 mg/mL时，碘比色法和Bernfeld法既能区分不同试样的区分阻糖食品的抑制效果，又能让方法选择对测试结果的影响减至最小。在α-淀粉酶浓度较低时，Bernfeld法能更灵敏的区分阻糖食品的抑制效果。当在α-淀粉酶浓度较高或有复合阻糖成分时，碘比色法能较好区分阻糖食品的抑制效果。同时，本文用PCR法未在7种无抑制效果但宣称能抗糖的食品中检出芸豆成分，网售抗糖食品存在一定的虚假宣传。