1. 研究背景
结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的《2020年全球癌症报告》显示，结直肠癌在全球癌症中发病率位居第三位，死亡率位居第二位，并呈不断上升趋势。而结直肠癌在我国也是发病率位居第三位、死亡率位居第五位的恶性肿瘤 [1]。结直肠癌的预后监测主要依靠动态的血清癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen, CEA)评估、影像学和(或)结直肠镜检查，其中血清CEA也是目前临床最简便的监测指标。CEA蛋白是1965年由Gold和Freedman首先从结直肠肿瘤和胚胎组织中提取的一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于内胚层细胞分化而来的癌症细胞表面，是细胞膜的结构蛋白 [2] [3]。目前血清CEA已作为结直肠癌患者诊断和监测最常用的肿瘤标志物，但其检测阳性率也仅为60%~70%，存在大量血清CEA正常的结直肠癌患者无法利用血清CEA进行动态和评估病情变化的情况。
血常规分析作为临床最常用的检查方法，其具有方便、快捷、便宜、可重复的优点。目前研究表明，外周血常规中某些细胞成分的变化与多种肿瘤患者的治疗反应、临床预后密切相关：如血常规中的中性粒细胞/淋巴细胞比例(neutrophils to lymphocytes ratio, NLR)已证实与多种实体肿瘤的临床预后密切相关 [4] [5] [6] [7]，且其动态变化也有助于预测治疗效果。而中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等也均有研究报道与肿瘤患者的治疗效果和临床预后有一定相关性 [8] [9]。由于免疫–炎症反应参与了结直肠癌的发生、侵袭和转移等多个过程，也对肿瘤的归转有重要影响，因此通过免疫–炎症因子有可能替代传统血清肿瘤标志物对肿瘤进行动态监测、疗效评价和预后预测。
因此，为探讨在临床上如何对血清CEA正常的结直肠癌患者进行病情监测和预后评估，本研究拟分析外周血常规指标在血清CEA水平正常的结直肠癌患者预后监测中的应用价值。
2. 研究方法
2.1. 一般资料
收集2015年1月至2018年12月于广州医科大学附属肿瘤医院连续收治的结直肠癌患者的临床资料。纳入标准：① 年龄为18~80岁的经肠镜活检确诊的结直肠腺癌患者；② 接受结直肠癌根治性切除术，术后病理分期为pTNM II-III期；③ 手术前未接受过相关抗肿瘤治疗；④ 临床和随访资料较完整。排除标准：① 术前接受过放疗、化疗、靶向治疗等辅助治疗；② 术前未进行血常规检测或血常规检测时间超出1个月；③ 合并其他肿瘤。根据纳入和排除标准，本研究共纳入327例结直肠癌患者，其中，男168例，女159例。所有患者的年龄范围为24~80岁，平均年龄为(59.61 ± 11.71)岁。以血清CEA = 5.00 ng/ml为临界值(参考2018中华人民共和国国家卫生健康委员会临床常用免疫学检验项目参考区间WS/T645.2-2018)，CEA异常(CEA > 5.00) 149例，CEA正常178例。血清CEA正常的结直肠癌患者中，有130例患者的随访资料较完整。本研究所有纳入患者均已签署《广州医科大学附属肿瘤医院标本采样收集知情同意书》，研究方案经广州医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审批通过。
2.2. 资料收集
2.2.1. 临床资料的收集
收集全部患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移情况、肿瘤最大直径、TNM分期等临床资料。
2.2.2. 标本的采集
所有结直肠癌患者入院后采集次日清晨空腹静脉血5 ml，分为两份。一份用于外周血常规检测，向其加入枸橼酸钠抗凝剂3 ml，并置于二乙胺四乙酸二钾抗凝采集管中，采用BC-2300全自动血细胞分析仪检测各项血常规指标；另一份室温静置20~30分钟，用罗氏CO-BAS6000生化分析仪以3000 r/min离心10分钟，分离上层血清用ELISA法检测血清CEA的表达水平。
2.3. 随访方法
手术后通过门诊复查或电话的方式对患者进行随访，截止日期为2020年8月1日。术后1~2年每3个月随访1次，术后2年以上每半年随访1次。无瘤生存期DFS定义为自术后至肿瘤复发或发生转移(经影像学检查确认)或患者死亡时间。
2.4. 统计学分析
采用SPSS22.0统计软件对数据进行统计学分析。对于计量资料，若收集的数据服从正态分布则采用均数 ± 标准差进行统计描述；若收集的数据呈非正态分布则选择中位数(四分位数间距)进行统计描述。计量资料经方差齐性检验后采用独立样本t检验或Wilcoxon秩和检验。对于计数资料，则采用例数和率(%)进行统计描述，并采用卡方检验进行组间比较。患者血清CEA水平的多因素分析采用Logistic回归模型；血清CEA水平正常结直肠癌患者预后的多因素分析采用Cox回归模型。采用ROC曲线对相关指标评估血清CEA正常患者预后的效能进行分析。生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，生存情况的比较采用Log-rank检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. CEA正常组与异常组结直肠癌患者临床资料的比较
不同CEA分组结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结转移、脉管侵犯及血常规中的白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(Plt)、中性粒细胞绝对值(Neu)、单核细胞绝对值(Mon)及其百分比(Mon%)比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)；但患者的肿瘤分化程度外周血中性粒细胞百分比(Neu%)、淋巴细胞百分比(Lym%)、淋巴细胞绝对值(Lym#)、中性粒细胞比淋巴细胞值(NLR)、淋巴细胞比单核细胞值(LMR)、血小板比淋巴细胞值(PLR)与血清CEA水平有明显相关性(表1)。
Table 1. Comparisons of clinical data between normal and elevated serum CEA colorectal cancer patients (n = 327)
表1. CEA正常组与异常组结直肠癌患者临床资料的比较(n = 327)
注：a数据收集不全，分化程度缺失13例，肿瘤直径缺失118例；b采用X2检验；c不符合正态分布，采用Wilcoxon秩和检验；d采用t检验；*表示差异有统计学意义。
3.2. 结直肠癌患者血清CEA水平高低的影响因素分析
单因素分析结果显示，外周血中性粒细胞百分比(Neu%)、淋巴细胞绝对值(Lym#)、淋巴细胞百分比(Lym%)、中性粒细胞比淋巴细胞值(NLR)、血小板比淋巴细胞值(PLR)与血清CEA水平相关。将单因素分析中有统计学差异的因素纳入多因素分析，结果显示，外周血淋巴细胞绝对值(Lym#)是结直肠癌患者血清CEA水平高低的独立影响因素(P = 0.005) (表2)。
Table 2. Logistic analysis of impact factors between normal and elevated serum CEA colorectal cancer patients
表2. 结直肠癌患者CEA正常组与异常组影响因素的Logistic回归分析
注：ab相对于高分化腺瘤；*表示该因素的P值 < 0.05；各因素的赋值为性别(男 = 0，女 = 1)，年龄(<60 = 0，≥60 = 1)，肿瘤位置(右半结肠 = 0，左半结肠 = 1)，肿瘤细胞分化程度(高分化 = 0，中分化 = 1，低分化 = 2)，器官转移(否 = 0，是 = 1)，淋巴结转移(否 = 0，是 = 1)，脉管侵犯(否 = 0，是 = 1)，肿瘤直径(<4 = 0，≥4 = 1)，其余为连续性变量。
3.3. CEA正常组结直肠癌患者预后的Cox回归分析
对血清CEA水平正常的病例进行进一步单独分析，单因素分析结果显示，外周血淋巴细胞绝对值(Lym#)和淋巴细胞比单核细胞值(LMR)均与患者预后相关(P < 0.05) (表3)；而多因素相关分析结果显示，仅淋巴细胞绝对值(Lym#)为患者预后的独立相关因素(P = 0.031)。
Table 3. Cox regression analysis of prognostic impact factors in 130 normal serum CEA colorectal cancer patients
表3. 130例CEA正常结直肠癌预后影响因素的Cox回归分析
注：*表示该因素的P值 < 0.05。
3.4. Lym#对血清CEA正常结直肠癌患者预后的监测价值
ROC曲线分析结果显示，当以1.805 × 109/L为最佳临界值时，Lym#预测结直肠癌患者DFS的灵敏度为71.9%，特异度为53.1%，曲线下面积AUC为0.617 (95%CI: 0.511~0.724) (P < 0.05) (图1)。Lym# ≥ 1.805 × 109/L的血清CEA正常结直肠癌患者的DFS情况差于Lym# < 1.805 × 109/L的患者，差异有统计学意义(Log-rank = 5.803, P = 0.016) (图2)。
Figure 1. ROC curve of prognostic evaluation of peripheral lymphocytes count in 130 normal serum CEA colorectal cancer cases
图1. 外周血淋巴细胞计数评估130例血清CEA正常结直肠癌患者预后的ROC曲线
Figure 2. Kaplan-Meier curve of disease-free survival (DFS) of peripheral lymphocytes count in normal serum CEA colorectal cancer cases
图2. 外周血淋巴细胞计数评估血清CEA正常结直肠癌患者DFS的Kaplan-Meier曲线
4. 讨论
血清CEA一直是结直肠癌患者最常用的血液标志物，但临床上仍有30%以上的患者为血清CEA水平正常，为临床治疗评价和预后随访带来困难。本研究从该部分患者外周血常规指标中进行分析，结果发现外周血淋巴细胞绝对值偏高(截断值 ≥ 1.805 × 109/L)是血清CEA水平正常的结直肠癌患者术后复发的独立危险因素。
结直肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，由于其早期症状隐匿，患者出现症状就诊时已属中晚期，预后较差。根据世界卫生组织癌症研究中心的GLOBOCAN项目估计，2018年全球范围内的结直肠癌新发病例数约为180万，死亡人数约为88万，并呈逐步升高的趋势 [10]。对于治疗前血清CEA水平异常升高的患者，通常可通过血液CEA的动态变化评估其在治疗后的病情变化和临床预后。但对于血清CEA一直在正常水平的病例，则无法通过CEA这一指标进行监测，而目前临床上也缺乏有效和简便的监测指标对该部分患者进行动态评估。
研究表明，外周血常规中一些细胞成分的变化与多种肿瘤患者的预后相关。免疫系统参与结直肠癌的发生、侵袭和转移等过程被普遍认可，同时机体对癌细胞的炎症反应也影响肿瘤的进展 [11]。如外周血NLR、PLR值升高对预测结直肠息肉癌变具有一定的意义，并且NLR相比于CEA可能更有助于预测早期结直肠癌 [5]。而在接受根治性手术的结直肠癌患者中发现，高NLR和高PLR水平(截断值为≥5.26)患者的总体生存期(overall survival, OS)明显差于低NLR水平患者，并且是评判结直肠癌预后的独立危险因素 [6]。此外，术前外周血单核细胞 ≥ 0.45 × 109/L的结直肠癌患者的无进展生存期(progression-free survival, PFS)显著差于单核细胞数 < 0.45 × 109/L的患者 [9]。因此，目前相关的研究结论均认为，治疗前或术前外周血中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、血小板等数量和比值均与结直肠癌临床预后相关，且可能为独立影响因素 [8] [12]。
本研究表明，血清CEA水平正常组病例外周血淋巴细胞水平显著高于CEA异常组的病例，提示外周血淋巴细胞与血清CEA水平具有一定的相关性；由于血清CEA水平升高可用于评估患者肿瘤病情进展，因此外周血淋巴细胞绝对值降低也可能提示患者病情进展和预后不良。但针对血清CEA水平正常的结直肠癌病例进行分析，结果发现接受根治术后疾病复发组与无复发组病例的外周血淋巴细胞绝对值存在统计学差异：无复发组病例的淋巴细胞绝对值均值低于复发组的平均数。既往研究中认为淋巴细胞作为抗肿瘤免疫细胞的主要组成部分，淋巴细胞减少提示机体免疫功能异常及淋巴细胞介导的抗肿瘤效应减弱，进而导致肿瘤在机体内发生和发展。但本研究结果在针对血清CEA正常的结直肠癌病例时却发现相反的结论，与其他文献所得出的结论不同可能是由于外周血淋巴细胞不同亚群间组成变化所引起：如CD4+T淋巴细胞除辅助性T细胞-1 (T-helper cells-1, Th1)亚群介导肿瘤局部免疫反应以抑制肿瘤生长外，还存在Th2亚群，其主要分泌的IL-4因子能够活化促肿瘤作用的巨噬细胞从而造成肿瘤的增殖和转移 [13]；其次，还有部分淋巴细胞亚群可以通过促进肿瘤血管生成从而诱导肿瘤细胞增殖，或抑制抗肿瘤免疫应答，通过不同机制促进肿瘤进展与扩散 [14]。根据本研究中血清CEA水平正常的结直肠癌患者的淋巴细胞绝对值Lym#作出ROC曲线下面积AUC为0.617 (P < 0.05)，灵敏度为71.9%、特异度为53.1%，可以认为Lym#能够作为监测血清CEA水平正常的结直肠癌患者预后的指标。
综上所述，外周血淋巴细胞绝对值对血清CEA水平正常的结直肠癌患者预后有一定的监测价值，可以为结直肠癌治疗的临床实践提供新的思路。本研究作为回顾性研究，并存在样本量偏小等缺陷，可能导致结论存在一定的偏差。未来还需要开展大样本量的前瞻性研究以及针对淋巴细胞亚群分析，以进一步验证该结果。
5. 结论
外周血淋巴细胞绝对值与血清CEA水平呈负相关，外周血淋巴细胞绝对值降低可能提示患者预后不良。而在血清CEA水平正常的情况下，外周血淋巴细胞绝对值偏高是患者预后不良的独立危险因素，并且能够较好地评估和监测血清CEA水平正常患者术后复发转移的风险，对临床治疗有一定的指导意义。
基金项目
2018年国家自然科学基金面上项目(81872035)、2018年广东省医学科研基金指令性课题项目(C2018089)。
NOTES
*通讯作者。