1. 引言
制备病毒类疫苗，目前普遍认为单个培养容器内细胞面积越大，病毒滴度越高，因此，发明了各种扩大细胞培养面积的容器及培养方法。从静止培养、旋转培养、细胞工厂培养到反应器培养等。本试验数据表明：单个培养容器内细胞面积在一定范围内，并不是面积越大，病毒滴度就越高，它们之间不存在正比关系，本文就此做一报道。
2. 材料与方法
风疹单次病毒收获液制备分为MRC-5细胞复苏、传代培养、洗换、接种病毒、单次病毒收获液收获等步骤。合格的单次病毒收获液配制原液、半成品，半成品分装、冻干，制备疫苗成品。通过使用不同细胞培养容器、不同工艺制备风疹单次病毒收获液，来说明不同细胞面积培养病毒对病毒滴度的影响。
2.1. MRC-5细胞和风疹病毒RA27/3株
购自美国ATCC。
2.2. 复苏液和培养液
复苏液为20%新生牛血清MEM液，NaHCO3调至适宜pH值，用于细胞复苏。培养液为10%新生牛血清MEM液，NaHCO3调至适宜pH值，用于细胞传代培养。新生牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。MEM购自上海源培生物科技股份有限公司。NaHCO3购自自贡鸿鹤制药有限责任公司。
2.3. 维持液
用于病毒培养。199培养基溶液，NaHCO3调至适宜pH值，用于静止培养与旋转培养的比较。MEM液，NaHCO3调至适宜pH值，用于旋转培养与细胞工厂培养的比较。199培养基和MEM培养基均购自上海源培生物科技股份有限公司。
2.4. 培养瓶
5 L瓶静止培养细胞面积为600 cm2，5 L瓶旋转培养细胞面积为1500 cm2。5 L刻度血清瓶购自四川蜀玻集团有限责任公司。
2.5. 细胞工厂
10层细胞工厂细胞面积为6360 cm2。10层细胞工厂购自康宁公司。
2.6. MRC-5细胞复苏、传代培养
将26代细胞复苏，按1:2或1:4的比例传代至33代，分别接种5 L瓶(进行静止培养和旋转培养)和10层细胞工厂。静止培养是将5 L培养瓶放置到台面上，于37℃ ± 1℃进行培养，让细胞贴到瓶壁上生长，细胞在有培养液的瓶壁上生长，其面积为600 cm2。旋转培养是将5 L培养瓶放置转瓶机上，于37℃ ± 1℃进行培养。培养瓶随着转瓶机的运行而旋转，因此，称为转瓶，细胞就贴到瓶壁上生长，其面积为1500 cm2。细胞工厂培养是将10层细胞工厂，放置到37℃ ± 1℃进行静止培养，细胞贴到向上的面上生长，其面积为6360 cm2。
2.7. 5 L瓶静止培养与旋转培养的比较
细胞长成致密单层后，洗换，洗去牛血清，接种风疹病毒。5 L瓶接种病毒后，换入199维持液，进行静止培养与旋转培养(转瓶)。两种方法每瓶液量均为1500 mL，放置31℃ ± 1℃培养。定期观察细胞，根据细胞状态及病变形态，确定病毒液收获时间。
2.8. 5 L瓶旋转培养与10层细胞工厂培养的比较
细胞长成致密单层后，洗换，洗去牛血清，接种风疹病毒。5 L转瓶(旋转培养)与10层细胞工厂接种病毒后，换入MEM维持液，液量均为2000 mL，放置31℃ ± 1℃培养。定期观察细胞，根据细胞状态及病变形态，确定病毒液收获时间。
2.9. 单次病毒收获液收获
一般病毒培养6、2、1天分别进行收获，第一、二次收获后，换入新的维持液继续培养。将风疹病毒液加入稳定剂，即为单次病毒收获液，混合均匀，取样，进行病毒滴定。
5 L瓶静止培养与旋转培养的比较试验，两种方法单次病毒收获液收获时，病毒液与稳定剂的比例均为4:1，即每个5 L瓶每次可以收获单次病毒收获液1875 mL。
5 L瓶旋转培养与10层细胞工厂培养的比较试验，两种方法单次病毒收获液收获时，病毒液与稳定剂的比例均为4:1，即每个5 L转瓶和每个10层细胞工厂每次可以收获单次病毒收获液2500 mL。
2.10. 风疹单次病毒收获液病毒滴定
采用微量细胞病变法 [1]。
2.11. 统计学方法
资料的统计分析由Excel统计软件完成。
3. 结果
3.1. 5 L瓶静止培养与旋转培养的比较
5 L瓶静止培养与旋转培养制备风疹单次病毒收获液，病毒滴度结果“见表1”。
Table 1. Statistics of single virus harvest fluid
表1. 单次病毒收获液统计
由表1可见，两种方法制备的单次病毒收获液病毒滴度相同，经统计学分析，P值为0.867，>0.05，差别无显著性。
3.2. 5 L瓶旋转培养与10层细胞工厂培养的比较
5 L瓶旋转培养与10层细胞工厂培养制备风疹单次病毒收获液，病毒滴度结果“见表2”。
Table 2. Statistics of single virus harvest fluid
表2. 单次病毒收获液统计
由表2可见，两种方法制备的单次病毒收获液病毒滴度相差不大，经统计学分析，P值为0.551，>0.05，差别无显著性，即病毒滴度相同。
4. 讨论
病毒类疫苗生产使用细胞培养病毒，为了扩大产量，往往采取增加细胞面积的方法。增加细胞面积的方法，一个是增加培养容器的数量，一个是增加单个容器的细胞面积来实现。虽然增加培养容器的数量可以提高疫苗产量，但是此方法有一定的局限性，受制于厂房的规模，培养容器不可能无限增加，因此，又发明了增加容器培养面积的方法。将培养瓶从2 L、3 L发展到10 L、15 L。为了进一步增加单个容器的细胞面积，病毒培养从静止培养、旋转培养、细胞工厂培养到反应器培养 [2] - [7]。静止培养、旋转培养、细胞工厂培养属于一个级别的，细胞面积相差不是特别悬殊，而反应器培养细胞面积与其他培养方法相差就不是一个级别了，在此不做探讨。
风疹病毒培养，5 L瓶静止培养细胞面积为600 cm2，5 L瓶旋转培养细胞面积为1500 cm2，10层细胞工厂培养细胞面积为6360 cm2。5 L瓶旋转培养细胞面积是静止培养的2.5倍，病毒滴度没有差别；10层细胞工厂细胞面积是5 L瓶旋转培养的4倍多，病毒滴度也没有差别，由此可以推断10层细胞工厂培养与5 L瓶静止培养，病毒滴度没有差别。10层细胞工厂培养细胞面积是5 L瓶静止培养的10倍多，因此，单个培养容器细胞面积相差在10倍以内，与病毒滴度不存在正比关系，即不是细胞面积越大，病毒滴度就越高。10 L瓶旋转培养细胞面积为2130 cm2，是5 L瓶旋转培养细胞面积的1.4倍。本公司曾经使用10 L瓶旋转培养制备风疹单次病毒收获液，后来改为5 L瓶旋转培养制备风疹单次病毒收获液，多年生产中，病毒滴度及产量均没有降低，也验证了上述试验结果 [8]。
单个培养容器细胞面积相差10倍以内，细胞面积与病毒滴度不成正比关系的原因，有待于探讨。根据此试验结果，可以对现有病毒培养方法进行改良，既可以节省细胞，减少操作时间，降低污染风险，又可以增加单产，节约成本，提高效率。