基于线粒体D-loop序列的辽宁刀鲚三个群体遗传分析

Genetic Structure Analysis of Three Wild Populations of Coilia nasus in Liaoning Province Based on Mitochondrial D-loop Sequences

摘要: 以辽河、大洋河及鸭绿江3个水系的75尾刀鲚(Coilia nasus)为试验材料，利用PCR扩增和测序技术研究了3个刀鲚群体的遗传结构。获得的1130~1171 D-loop同源序列中检测出94变异位点和60个单倍型，总群体单倍型和核苷酸多样性指数分别为0.992 ± 0.004和0.010 ± 0.000。分子方差分析(AMOVA)结果表明，98.27%遗传变异来自群体内，群体间遗传分化较小，单倍型聚类分析和网络图显示单倍型分布没有明显的地理谱系结构，3个群体可作为一个遗传管理单元。该结果可为刀鲚的种质资源保护提供参考。

Abstract: The genetic structure of Coilia nasus was studied based on the sequences analysis of mitochondrial D-loop in 75 individuals from Liao River (n = 20), Dayang River (n = 27) and Yalu River (n = 28), Liaoning province. In 1130~1171 bp of D-loop sequences, there were 94 polymorphic sites and 60 haplotypes. The haplotype and nucleotide diversities were 0.992 ± 0.004 and 0.010 ± 0.000, respectively. AMOVA revealed 98.27% of the total variation was resulted from intra-population differentiation, there was little genetic differentiation among populations. Both NJ tree and MJ network of 60 haplotypes indicated there was no geographic structure among populations. Three populations of C. nasus should be considered as a genetic management unit. The findings may be very useful to protect this species stock.

1. 引言

刀鲚(Coilia nasus)又称刀鱼、凤尾鱼，隶属于鲱形目(Clupeiformes)鳀科(Engrulidae)鲚属(Coilia)，是一种中小型洄游鱼类 [1]。在中国，刀鲚常见于黄海、东海及长江中下游水域，辽宁地区的辽河、大洋河及鸭绿江亦有分布 [2]。在长江中下游地区，刀鲚作为一种高价值的名贵鱼类深受市场青睐。受过度捕捞和栖息地环境破坏的影响，长江刀鲚资源量从上世纪70年代起急剧下降 [3]，现在的年捕获量仅相当于历史最高产量的2% [4]。目前，有关刀鲚的研究主要集中在分类学 [5] [6] [7]、资源现状 [8] [9] [10]、繁养殖技术 [11] [12] [13]、种群生态学 [14] [15] [16]、营养成分分析 [17] [18] 等几个领域。有关刀鲚群体遗传结构的研究也有报道，但这些研究多集中在长江流域的群体 [20] - [27]，基于线粒体D-loop序列的辽宁刀鲚群体的遗传结构研究还未见报道。

线粒体DNA (mtDNA)作为重要的遗传标记，具有进化速度快、核苷酸替代率高和母系遗传的特点，而D-loop序列属于非编码区，是mtDNA进化速度最快的区域，常用于鱼类进化生物学和群体遗传学研究 [28] [29]。本研究以采自辽河、大洋河和鸭绿江的刀鲚样本为试验材料，对其线粒体D-loop序列进行了PCR扩增和生信分析，旨在为掌握3个刀鲚野生群体遗传结构和保护刀鲚种质资源提供理论支撑。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2019年7月至2020年10月，笔者采用流刺网捕获了了3个水系75尾野生刀鲚，包含辽河群体20尾(LH)、大洋河群体27尾(标记为DYH)和鸭绿江群体28尾(标记为YLJ) (见表1)。样本体长为17.5~28.9 cm，体重为13.98~75.05 g。每尾剪取背部肌肉1~2 g，保存于装有95%酒精EP管内带回实验室。

Table 1. Sampling details of C. nasus used in this study

表1. 刀鲚样品来源信息

2.2. 方法

2.2.1. DNA提取、引物设计、PCR扩增及测序

取肌肉0.1g左右，利用基因组提取试剂盒(Tiangen, DP304)提取总DNA。扩增D-loop序列的引物为DF (5′-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3′)和DR (5′-ATCTTAGCA TCTTCAGTG-3′) [30]。PCR反应体系为25 μL，包括2.5 μL 10 × PCR buffer (Mg²⁺ plus，20 mM)、2 μL dNTP mix (2.5 mM)、0.25 μL Taq DNA polymerase (5 U/μL)、上下游引物各1 μL (10 μM)、模板1 μL，用双蒸水补足至25 μl。所有的PCR反应均在ABI 9700扩增仪上进行，PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；35个循环，每个循环包括94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1min 30 s；最后73℃总延伸10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，获得目的条带的产物至生工生物(上海)有限公司进行纯化，并由ABI 3730全自动测序仪双向测序和拼接。

2.2.2. 数据处理

获得的序列经Clustal W比对剪切后，运用MEGA6.0软件包计算序列碱基组成、变异位点数和转换与颠换值；并基于Kimura双参数法(Kimura 2-parameter, K2p)模型构建系统进化树，采用Bootstrap (1000个循环)检验节点的置信度。利用DnaSP (version 6.10.04)软件计算单倍型数、单倍型多样性及核苷酸多样性等参数。应用Arlequin 3.5软件中进行分子变异分析(AMOVA)。此外，运用Network 10.2.0.0软件构建单倍型网络图，分析单倍型与群体间的对应关系。

3. 结果

3.1. D-loop序列分析

75尾个体的D-loop序列中，获得了1130~1171 bp同源序列(见表2)，D-loop基因序列的A、T、G、C含量分别为33.2%、33.4%、19.4%和14%，A + T含量(66.6%)大于G + C (33.4%)，呈现出明显的AT偏好。序列中检测出94个变异位点，约占总位点的8%，其中包含简约信息位点50个、单突变位点44个。各群体发生碱基转换/颠换数相近，总体发生碱基转换的位点有9个，发生碱基颠换的位点有2个。所有序列总的碱基插入/缺失数为79个，其中YLJ群体插入/缺失数最高(76个)，DYH群体次之(43个)，LH群体最小(40个)。3个群体共检测到60个单倍型，单倍型数由高到底依次为YLJ > DYH > LH；单倍型多样性指数相近，均接近于1；3群体中LH和YLJ群体的核苷酸多样性指数相等(0.010 ± 0.001)，略大于DYH群体(0.009 ± 0.001)；平均核苷酸差异数以LH群体最高，YLJ群体次之，DYH群体最小。

Table 2. Genetic diversity parameters of 3 populations of Coilia nasus based on D-loop sequences

表2. 3个刀鲚群体D-loop序列的遗传多样性参数

^*比对位点数。

3.2. 群体遗传结构

3个群体间遗传距离、遗传分化指数见表3。3个群体的群体内遗传距离均为0.010 ± 0.000；群体间遗传距离为0.009~0.011，其中YLJ与LH群体间距离最大，YLJ与DYH群体间次之，DYH与LH群体间最小。群体间的遗传分化指数为−0.028~0.044，均小于0.05，表明群体间遗传分化极小。AMOVA分析可知(见表4)，群体间和群体内遗传变异占比分别为1.73%和98.27%，表明群体间的遗传分化较低，群体内的遗传变异为总变异的主要来源。

Table 3. Genetic fixation index (Fst) (upper diagonal) and genetic distance between (below diagonal) and within (diagonal) C. nasus populations

表3. 刀鲚群体间遗传分化指数(右上角)、遗传距离(左下角)及群体内遗传距离(对角线)

Table 4. The AMOVA analysis among 3 populations of C. nasus

表4. 3个刀鲚群体间遗传变异的分子方差分析(AMOVA)

3.3. 单倍型分布与聚类分析

在定义的60个单倍型中(见表5)，单倍型Hap11为3个群体共享单倍型，占样本数的6.67%；Hap9、Hap10和Hap20为LH与DYH群体共享单倍型，Hap53和Hap40分别为LH与YLJ、DYH与YLJ群体的共享单倍型。其余单倍型为各群体所独有，这些单倍型出现的频率很低，仅由群体内1~2个样本持有，各群体独有单倍型数量由高到低依次为：YLJ (20个) > DYH (18个) > LH (15个)。此外，基于60个单倍型建立的NJ树(见图1)表明，各群体的单倍型交错地聚集在一起，并没有形成明显的地理分支结构。同样，在MJ网络图中(见图2)，不同群体的单倍型彼此分散相连，未形成地理群体枝系。

Table 5. Distribution and the number of mtDNA D-loop haplotypes in each population of C. nasus

表5. 3个刀鲚群体D-loop序列单倍型数量与分布

Figure 1. The NJ tree of 60 haplotypes for 3 populations of C. naus in Liaoning province

图1. 辽宁地区3个刀鲚群体基于60个线粒体D-loop单倍型的NJ树

注：圆圈大小代表对应的单倍型频率

Figure 2. The MJ network of 60 haplotypes for 3 C. nasus populations in Liaoning province

图2. 辽宁地区3个刀鲚群体基于60个单倍型的MJ网络图

4. 讨论

4.1. 群体遗传多样性

物种遗传多样性与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关，遗传变异是有机体适应环境的必要条件 [31] [32]。衡量物种或种群线粒体DNA变异程度指标主要有单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π) [33]。本研究中测定的3个刀鲚群体75个样本共检测到94个变异位点和定义了60个单倍型，单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数分别为0.989~1.000和0.009~0.010。单倍型多样性指数与长江口临近水域刀鲚(h: 0.9848~1.0000) [22]、日本刀鲚(h = 1) [34] 相近，但高于养殖刀鲚(h = 0.873) [23]；核苷酸多样性指数略低于长江口临近水域刀鲚(π: 0.0089~0.3630) [22]，但要高于养殖刀鲚(π = 0.0055) [23] 和日本刀鲚(π = 0.0061) [34]。此外，3个刀鲚群体遗传多样性指数略高于太湖(h = 0.929；π = 0.00594)、滆湖(h = 0.951；π= 0.01036)、高邮湖(h = 0.728；π = 0.00556)、白马湖(h = 0.918；π = 0.00638)、洪泽湖(h = 0.726；π = 0.00552)和骆马湖(h = 0.816；π = 0.00602)几个定居生态型群体 [35]。这一结果表明，尽管受到环境污染、过度捕捞等不利因素的影响，辽宁地区3个刀鲚群体自然群体数量下降趋势明显，但其遗传多样性指数仍处于较高水平，对环境适应能力及进化潜力较大，具有较高的种质资源保护价值和开发及利用潜力。

4.2. 种群遗传分化

群体间遗传距离以及遗传分化指数是衡量群体分化程度的重要指标，二者的数值与群体分化程度为线性关系 [36]，鱼类遗传分化格局与其分布的水系格局及地理距离密切相关 [37]。本研究中3个群体样本来自辽河(LH)、大洋河(DYH)和鸭绿江(YLJ)水系，其中大洋河位于辽河和鸭绿江之间。三群体采样点之间的直线距离关系如下：LH与YLJ (200 km) > LH与DYH (160 km) > DYH与YLJ (50 km)。3刀鲚群体间的遗传距离为0.009~0.011，其中DYH与LH群体遗传距离最小(0.009 ± 0.002)，DYH与YLJ群体的遗传距离次之(0.010 ± 0.002)，LH与YLJ群体遗传距离最大(0.011 ± 0.002)，即3刀鲚群体的遗传结构关系与水系分布及地理距离并不完全相符，相似的结果在乔氏新银鱼(Neosalanx jordani) [37] 和太湖新银鱼(Neosalanx taihuensis) [38] 也有报道。Wright [39] 指出，遗传分化指数F_st在0到1范围内，值越大两种群的分化程度越高。F_st为0~0.05表示极小遗传分化；F_st为0.05~0.15表示中度遗传分化；F_st为0.15~0.25表示较大遗传分化；F_st大于0.25，表示有极大的遗传分化 [40]。本研究中F_st为−0.028~0.044，属于极小遗传分化水平，且统计检验不显著。AMOVA分析结果显示，遗传变异主要来自群体内，群体间的遗传分化极小，这与长江口临近水域刀鲚(C.nasus) [22]、辽宁沿海细纹鰤子鱼(Liparis tanakae) [41] 种群遗传结构研究结果相似。单倍型聚类分析和网络图也支持上述观点：3群体的单倍型相互交错地聚在一起，并没有形成与水系相对应的地理分支。这种遗传分化格局可能与两个因素有关：1) 种群扩张过程中多次独立建群事件。Kamal等 [42] 研究表明，多次独立远距离建群事件可导致淡水生物流域间差异不明显的遗传分化格局；2) 刀鲚淡水产卵、海水越冬的洄游习性。刀鲚进入海水后群体间地理阻隔变小，3群体可能存在相互重叠的越冬场，群体间基因交流频繁致使遗传分化较小。

4.3. 辽宁刀鲚资源保护

本研究表明，辽河、大洋河和鸭绿江三个刀鲚群体具有较高的遗传多样性，预示其对环境具有较强的适应性，具有较大的进化潜能和丰富的遗传选育潜力。同时，3个刀鲚群体间和群体内遗传距离在0.009~0.010之间，且处于一个水平，群体间遗传分化程度较低，可以作为一个遗传管理单元。鉴于当前辽宁刀鲚自然群体数量急剧减少的现状，今后应从渔政管理、科技支撑和产业化推广多角度推进刀鲚资源养护工作，以更好地保护、开发和利用这一名贵种质资源。

5. 小结

本研究利用D-loop分子标记对辽宁地区三个刀鲚群体遗传结构进行了分析，数据显示3个刀鲚群体具有较高的遗传多样性，保护、开发及利用价值较大，应加强其资源养护工作。同时，鉴于线粒体基因自身的缺点 [43] 和本研究采集的样本量较小，今后应采用包括核基因在内的多种分子标记来分析更多的样本以获取更加可靠的数据。

基金项目

辽宁省农业农村厅项目(JH20-210000-39754)、辽宁省农科院项目(2021HQ1918、2020JXJL006)及辽宁省科技厅项目(2021JH2/10200031)。

NOTES

^*通讯作者。