硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌Epichloe^¨sp.固体培养菌丝体矿质营养的影响

Effect of Se Concentration and Culture Time on Mineral Nutrition in Mycelia of Epichloe^¨sp. from Festuca sinensis in Solid Culture

摘要: 探讨硒浓度对中华羊茅内生真菌Epichloë sp.固体培养过程中菌丝体矿质营养的影响。样品经微波消解后，分别采用钼蓝比色法、四苯硼钠法、偶氮氯膦III法、邻菲罗啉比色法、氢化物原子荧光光谱法检测磷、钾、钙、铁、硒的含量。结果表明：硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌Epichloë sp.菌丝体磷、钙、硒含量的影响达到显著或极显著水平(P < 0.05, P < 0.001)。当添加硒浓度0.2~0.4 mmol/L时，菌丝体钾含量在不同培养时间之间存在显著或极显著水平(P < 0.05, P < 0.001)；而硒浓度0.1~0.3 mmol/L时，菌丝体铁含量在不同培养时间之间存在显著或极显著水平(P < 0.05, P < 0.001)。当培养4周~6周时，适宜的硒浓度提高菌丝体磷、钾、铁和钙含量；菌丝体中硒含量随着添加硒浓度的量而显著增加(P < 0.05)，随着培养时间的延长其变化呈现升降。适宜的亚硒酸钠能提高中华羊茅内生真菌Epichloë sp.固体培养菌丝体吸收矿质营养。

Abstract: This study was to investigate the effects of different selenium concentrations and culture time on mineral nutrition in mycelium of Epichloë sp. from Festuca sinensis in solid culture. The levels of P, K, Ca, Fe and Se contents in mycelial sample digested by microwave digestion oven were detected by molybdenum blue, sodium tetraphenylborate, chlorophosphonazo III, phenanthroline method, and atomic fluorescence spectroscopy, respectively. The results showed that the highly significant or significant effects of selenium treatment or culture time were detected for P, Ca, Se concentrations of mycelia of Epichloë sp. from F. sinensis (P < 0.05, P < 0.001). The presence of 0.2~0.4 mmol/L was the highly significant or significant effects detected on K content for mycelia of Epichloë sp. The presence of 0.1~0.3 mmol/L was the highly significant or significant effects detected on Fe content for mycelia of Epichloë sp. After incubation for 4 to 6 weeks, selenium at appropriate concentrations promoted P, K, Fe, and Ca concentrations. Selenium concentration of solid medium significantly increased with the increased concentrations of selenite (P < 0.05), and increased first, and then decreased with the prolongation of incubation time. The addition of appropriate Na2SeO3 concentrations contributed to higher levels of mineral nutritions in mycelia of Epichloë sp. from F. sinensis.

1. 引言

禾草内生真菌是指生长在禾草体内并完成全部或大部分生活周期，而不显示外部症状的一类真菌 [1] 。中华羊茅(Festuca sinensis)隶属早熟禾族(Poeae)羊茅属(Festuca)，南志标曾报道中华羊茅普遍感染内生真菌 [2] ，从中华羊茅种子中分离出一些内生真菌菌株，对其生物学与生理学特性进行了研究 [3] ，也发现了中华羊茅内生真菌在形态上存在多样性 [4] ，基于actin序列分析8个不同地理种群的中华羊茅Epichloë的鉴定和系统发育关系 [5] ，中华羊茅内生真菌发挥着多种生物活性 [6] [7] ，但是有关中华羊茅内生真菌吸收矿质营养的研究相关报道较少。

诸多研究表明矿质元素影响着菌体生长以及对营养物质的吸收 [8] [9] ，而合适的矿质元素种类、浓度梯度有利于菌丝体生长以及富集矿质元素 [10] [11] 。硒是生物必需微量矿质元素之一，适宜硒浓度能促进真菌生长、提高抗氧化活性和代谢产物 [12] [13] [14] ，真菌能将培养环境中的无机硒转化为有机硒 [15] 。当培养液中加入不同浓度的硒化合物后，导致真菌在生长过程中菌丝体或发酵液的营养成分发生变化 [16] [17] [18] [19] 。本试验通过添加不同亚硒酸钠浓度，初步探讨固体培养过程中华羊茅内生真菌菌丝体矿质营养的变化，旨在为解释内生真菌富硒特性提供一定的数据参考。

2. 材料和方法

2.1. 材料

2.1.1. 菌株

中华羊茅内生真菌菌株Epichloë sp.保存于青海师范大学微生物实验室。

2.1.2. 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL、pH自然。

2.2. 方法

2.2.1. 中华羊茅内生真菌Epichloë sp.活化

将中华羊茅内生真菌Epichloë sp.接种到PDA平板上，于25℃ ± 1℃培养1个月。

2.2.2. 不同硒浓度对中华羊茅内生真菌固体培养矿质营养的影响

分别制备含有亚硒酸钠浓度为0 (CK)、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L的平板，用打孔器打孔至菌落成直径4 mm的菌块，接种于90 mm的PDA平板上，每个皿中的3块呈三角形排列，于恒温培养箱中25℃ ± 1℃培养，在富硒培养过程中，用解剖刀小心刮取培养4周、5周、6周、7周、8周相同量的菌丝，放入−20℃的冰箱中备用。

2.3. 测定指标

样品中加入消解液，经微波消解后消化液采用钼蓝比色法 [20] 、四苯硼钠法 [21] 、偶氮氯膦III法 [22] 、邻菲罗啉比色法 [20] 分别测定磷、钾、钙、铁的含量，采用GB5009.93-2017(第一法氢化物原子荧光光谱法)测定硒含量 [23] 。

2.4. 统计分析

试验数据结果均采用平均值 ± 标准误表示，各项指标釆用SPSS16.0统计分析软件进行单因素方差分析(LSD, P < 0.05)。采用Spearman双侧检验矿质营养之间的相关性分析。

3. 结果与分析

3.1. 硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体磷含量的影响

硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌Epichloë sp.菌丝体磷含量的影响达到显著或极显著水平(P < 0.05, P < 0.001) (表1)。表2结果表明：当培养时间为4周~8周时，硒浓度为0.1、0.2、0.3 mmol/L时菌丝体磷含量呈现先升后降趋势，菌丝体磷含量均于第7周达到最大值，其含量显著高于其它培养时间(P < 0.05)；当硒浓度为0.4 mmol/L时，培养第8周的菌丝体磷含量明显高于其他培养时间(P < 0.05)；不加硒组第7周、8周培养的菌丝体磷含量显著高于培养时间4周~6周的菌丝体磷含量(P < 0.05)。当培养时间为4周时，不加硒时菌丝体磷含量显著低于添加硒浓度0.2、0.3、0.4 mmol/L的菌丝体中磷含量(P < 0.05)；当培养时间为5周时，加硒组菌丝体磷含量显著高于对照组(P < 0.05)；当培养时间为6周或7周时，对照组菌丝体磷含量显著高于加硒浓度0.2、0.3、0.4 mmol/L的菌丝体；当培养时间为8周时，加硒组菌丝体磷含量显著低于对照组(P < 0.05)。

Table 1. Results of one-way ANOVA for the effects of Se treatment or culture time on mineral nutrition in mycelium of Epichloë sp. from F. sinensis in solid culture

表1. 硒浓度或培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体矿质营养影响的方差分析

Table 2. Effect of Se concentration on P concentration in mycelium of Epichloë sp. from F. sinensis in solid culture

表2. 硒浓度或培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体中磷含量的影响

注：同行中小写字母表示同一浓度不同周次之间的显著性差异(P < 0.05)，同列中大写字母表示相同周次不同浓度之间的显著性差异(P < 0.05)。

3.2. 硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体钾含量的影响

当添加硒浓度0.2~0.4 mmol/L时，菌丝体钾含量在不同培养时间条件下存在显著或极显著差异(P < 0.05, P < 0.001)；当培养时间5周时，不同硒浓度条件下钾含量存在极显著性差异(P < 0.001) (表1)。硒浓度和培养时间对菌丝体钾含量的影响结果见表3。当培养时间为4周~8周时，对照组中菌丝体钾含量差异不显著；当硒浓度为0.1 mmol/L时，培养第7周的菌丝体钾含量显著低于培养时间为5周和8周菌丝体钾含量(P < 0.05)；当硒浓度为0.2 mmol/L时，培养第7周的菌丝体钾含量显著低于培养时间为6周和8周菌丝体钾含量(P < 0.05)；当硒浓度为0.3、0.4 mmol/L时，菌丝体钾含量均于第8周达到最大值，并显著高于其他培养时间(P < 0.05)。当培养时间为4周时，加硒浓度为0.3 mmol/L的菌丝体钾含量明显低于加硒浓度为0.1、0.2 mmol/L的菌丝体中钾含量(P < 0.05)；当培养时间为5周时，加硒浓度为0.1 mmol/L的菌丝体钾含量明显高于其他处理组(P < 0.05)；当培养时间为6周时，加硒浓度为0.2 mmol/L的菌丝体钾含量明显高于对照和加硒浓度为0.4 mmol/L的菌丝体钾含量(P < 0.05)；当培养时间为7周时，加硒浓度为0.2 mmol/L的菌丝体钾含量明显低于对照(P < 0.05)；当培养时间为8周时，加硒浓度为0.3 mmol/L的菌丝体钾含量明显高于对照(P < 0.05)。

Table 3. Effect of Se concentration on K concentration in mycelium of Epichloë sp. from F. sinensis in solid culture

表3. 硒浓度或培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体中钾含量的影响

注：同行中小写字母表示同一浓度不同周次之间的显著性差异(P < 0.05)，同列中大写字母表示相同周次不同浓度之间的显著性差异(P < 0.05)。

3.3. 硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体钙含量的影响

硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌Epichloë sp.固体培养菌丝体钙含量的影响达到显著或极显著水平(P < 0.05, P < 0.001) (表1)。不同硒浓度和培养时间对菌丝体钙含量影响不一致(表4)。当培养时间为4周~8周时，对照组和加硒浓度0.3 mmol/L的菌丝体钙含量均于培养时间第7周达到最大值，其含量显著高于其他培养时间的钙含量(P < 0.05)；加硒浓度0.1、0.4 mmol/L的菌丝体钙含量均于第5周达到最大值，其含量显著高于其他培养时间(P < 0.05)；加硒浓度0.2 mmol/L的菌丝体钙含量于培养时间4周和7周时明显低于其他培养时间(P < 0.05)。当培养时间为4周时，加硒浓度为0.2、0.3 mmol/L的菌丝体钙含量明显高于其他处理组(P < 0.05)；当培养时间为5周时，加硒浓度为0.1 mmol/L的菌丝体钙含量明显高于加硒浓度0、0.2、0.3 mmol/L处理组(P < 0.05)；当培养时间为6周时，加硒浓度为0.2 mmol/L的菌丝体钙含量明显高于其他处理组(P < 0.05)；当培养时间为7周时，对照组和加硒浓度为0.3 mmol/L的菌丝体钙含量明显高于加硒浓度0.1、0.2、0.4 mmol/L处理组(P < 0.05)；当培养时间为8周时，对照组和加硒浓度为0.2 mmol/L的菌丝体钙含量明显高于加硒浓度0.1、0.3、0.4 mmol/L处理组(P < 0.05)。

Table 4. Effect of Se concentration on Ca concentration in mycelium of Epichloë sp. from F. sinensis in solid culture

表4. 硒浓度或培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体中钙含量的影响

注：同行中小写字母表示同一浓度不同周次之间的显著性差异(P < 0.05)，同列中大写字母表示相同周次不同浓度之间的显著性差异(P < 0.05)。

3.4. 硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体铁含量的影响

硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌菌丝体铁含量的影响见表1和表5。当添加硒浓度为0.1~0.3 mmol/L时，菌丝体铁含量在不同培养时间条件下存在显著或极显著性差异(P < 0.05, P < 0.001)；当培养时间为4、6、8周时，不同硒浓度下的铁含量存在显著性差异(P < 0.05) (表1)。当培养时间为4周~8周时，培养时间第4周对照组菌丝体铁含量显著低于培养时间为6周的铁含量(P < 0.05)；加硒浓度0.1 mmol/L的菌丝体铁含量于第8周达到最大值，其含量显著高于其他培养时间(P < 0.05)；加硒浓度0.2 mmol/L的菌丝体铁含量于培养时间4周时明显高于其他培养时间(P < 0.05)；加硒浓度0.3 mmol/L的菌丝体铁含量于培养时间6周时明显高于其他培养时间(P < 0.05)。当培养时间为4周时，加硒浓度为0.2 mmol/L的菌丝体铁含量明显高于对照组和加硒浓度0.1、0.3 mmol/L处理组(P < 0.05)；当培养时间为5周时，加硒浓度为0.2 mmol/L的菌丝体铁含量显显著低于加硒浓度0.2 mmol/L处理组(P < 0.05)；当培养时间为6周时，加硒浓度为0.3 mmol/L的菌丝体铁含量显显著高于其他处理组(P < 0.05)；当培养时间为7周时，加硒浓度为0.4 mmol/L的菌丝体铁含量显显著高于加硒浓度为0.1、0.2 mmol/L处理组(P < 0.05)；当培养时间为8周时，加硒浓度为0.1、0.4 mmol/L的菌丝体铁含量显显著高于其他处理组(P < 0.05)。

Table 5. Effect of Se concentration on Fe concentration in mycelium of Epichloë sp. from F. sinensis in solid culture

表5. 硒浓度或培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体中铁含量的影响

注：同行中小写字母表示同一浓度不同周次之间的显著性差异(P < 0.05)，同列中大写字母表示相同周次不同浓度之间的显著性差异(P < 0.05)。

3.5. 硒浓度和培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体硒含量的影响

培养时间和硒浓度对菌丝体硒含量的影响达到极显著水平(P < 0.001) (表1)。当培养时间相同时，对照组菌丝体中硒含量显著低于加硒组(P < 0.05)。在不加硒和硒浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L条件下，随着培养时间的延长菌丝体硒含量表现出先升后降趋势(表6)。对照组和硒浓度为0.1 mmol/L时菌丝体硒含量均于第7周达到最大值，其含量显著高于其它培养时间(P < 0.05)；在硒浓度为0.2、0.3、0.4 mmol/L条件下，培养第5周的菌丝体硒含量明显高于其他培养时间(P < 0.05)。

Table 6. Effect of Se concentration on Se concentration in mycelium of Epichloë sp. from F. sinensis in solid culture

表6. 硒浓度或培养时间对中华羊茅内生真菌固体培养菌丝体中硒含量的影响

注：同行中小写字母表示同一浓度不同周次之间的显著性差异(P < 0.05)，同列中大写字母表示相同周次不同浓度之间的显著性差异(P < 0.05)。

3.6. 矿质营养各组分之间的相关性分析

表7为磷、钾、钙、铁和硒含量组分之间的相关性分析结果。加硒组钙含量和铁含量存在较强的负相关性，达到显著水平(P < 0.05)；钾含量与硒含量之间的相关系数为－0.657，达到极显著水平(P < 0.01)。对照组磷含量与硒含量、钙含量与硒含量之间存在显著的正相关性(P < 0.05)；磷含量与钾含量之间的相关系数为0.995，达到极显著水平(P < 0.01)。

Table 7. Correlation of mineral nutritions in mycelia of Epichloë sp. from F. sinensis

表7. 中华羊茅内生真菌菌丝体矿质营养之间的相关性分析

注：^*表示差异显著(P < 0.05)，^**表示差异极显著(P < 0.01)。

4. 讨论与结论

矿质元素种类和浓度梯度影响着菌丝体生长以及富集矿质元素的能力 [10] [11] 。在PDA培养基中添加1000 mg/L的Ca(NO₃)₂能明显促进菌丝体生长，使钙的富集率达到0.07%；Fe₂(SO₄)₃为最适宜的铁源，当添加浓度为300 mg/L时铁的富集率高达0.29%；当添加175 mg/L浓度的ZnSO₄时，菌丝体中锌的富集率最高达到0.57% [11] 。尹智美采用添加2 μg/mL亚硒酸钠的发酵培养基作为雅致放射毛霉的培养基质，富硒菌丝体中钠、钾、钙、锌、硒、镉含量高于普通菌丝，而镁、锰、铜、钡、铅和锑的含量低于普通菌丝 [24] 。本试验发现随着硒浓度的增加菌丝体生长速度减慢，当培养4周~6周时，适宜的硒浓度提高菌丝体磷、钾、铁和钙含量(表2~5)；菌丝体中硒含量随着添加硒浓度的量而显著增加(P < 0.05)，随着培养时间的延长其变化呈现升降趋势(表6)。在加硒培养条件下中华羊茅内生真菌菌丝体钙含量与铁含量、钾含量与硒含量之间存在显著或极显著的负相关性(表7)；而在未加硒培养条件下菌丝体磷含量与硒含量、钙含量与硒含量、磷含量与钾含量之间存在显著或极显著的正相关性(表7)。由此可见，硒浓度和培养时间影响着中华羊茅内生真菌菌丝体吸收矿质营养，对于其他营养物质的吸收和利用有待研究。

基金项目

国家自然科学地区科学基金项目(31760697)。