1. 引言
cf-DNA (cell free DNA，简称cf-DNA)，是指血液中游离于细胞外的DNA [1]。cf-DNA对于临床早期诊断意义重大，随着cf-DNA分离纯化和鉴定技术日益完善，临床和科研上越来越重视cf-DNA的研究和诊断 [2] [3] [4]。cf-DNA与疾病关系密切，例如肿瘤细胞的DNA碎片可以游离到血液中，通过对血液中cf-DNA的鉴定，从而实现肿瘤的早期诊断，做到早发现早治 [5] [6]。胎儿的DNA也可以游离到孕妇的血液中，因此可以通过分析孕妇血液中胎儿cf-DNA，判断胎儿是否存在遗传疾病等 [7] [8]。
cf-DNA检测过程中的测序设备昂贵且样本量通常较少，为降低检测成本，医院多委托专业的第三方平台进行集中检验。从医院收集样本到第三方检测平台进行样本处理和检验时间至少需要2~3天，而普通的抗凝采血管收集的样本中cf-DNA含量在1天内即可发生降解，使得该项检验无法正常开展 [9] [10]。cf-DNA对于采血管的要求非常高，要具备保护cf-DNA不被降解，起到稳定保存的功能 [11] [12]。因此，对于维持血液中cf-DNA含量长时间稳定保存的采血管需求日益增加。
目前市场上已出售多种含有cf-DNA稳定剂的采血管，本文将本公司研发的采血管与市售两种品牌采血管进行对比，验证驼人研发采血管与市售采血管对血液样本cf-DNA保存效果。
2. 实时荧光定量PCR分析
2.1. 材料及仪器
驼人自主研发采血管(10 mL)，I品牌采血管，II品牌采血管，台式高低速冷冻离心机，实时荧光定量PCR仪(q-PCR)，24 Plus真空泵，QIAamp DNA Kit(50)货号为55128。
2.2. 标本来源和采集方法
征集志愿者，志愿者为驼人集团20~30岁员工，均知情并签署知情同意书。每位志愿者均采集驼人自主研发采血管，I品牌采血管，II品牌采血管3种10 mL采血管，每种采血管采集5个时间点标本，每管采集达到需要量之后血液会停止。采集完成后，轻轻颠倒混匀8~10次，让血液和稳定剂达到充分混合的状态。
2.3. cf-DNA提取
每种品牌管保存时间点为0~2 h、3 d、7 d、10 d、14 d，保存至设定好的时间点，将样本4℃条件3000 rmp离心10 min，取3 mL上层血浆至5 mL离心管，将5 mL离心管4℃条件10,000 rmp离心10 min进行离心取1.5 mL上层血浆至新的15 mL离心管。按照Qiagen公司QIAamp DNA Kit(50)货号为55128)提取操作步骤进行cf-DNA提取。
2.4. q-PCR检测cfDNA水平
本文采用人h-β-actin：基因片段来研究不同保存时间血浆中cfDNA水平变化情况 [13]，引物序列为：Forward 5’-AACTACCTTCAACTCCATCA-3’，Reverse 5’-GAGCAATGATCTTGATCTTCA-3’，反应体系为25 μL，上下游引物终浓度为0.2 μM，PCR热循环条件：95℃ 10 min，95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s共40个循环(结果见表1、图1)。
Table 1. Different brands of blood collection tubes save q-PCR quantitative ct values for cf-DNA
表1. 不同品牌采血管对cf-DNA保存q-PCR定量ct值
Figure 1. The change curve of qPCR quantitative ct value of different brands of blood collection tubes on cf-DNA storage
图1. 不同品牌采血管对cf-DNA保存q-PCR定量ct值变化曲线
3. 临床应用验证
3.1. 样本来源及采集方法
选取已确诊肿瘤患者5名，受试者A、B、C、D、E均使用驼人采血管(10 mL)，I管，II管，II管各1管血液，C、D、E患者均使用第三方平台提供采血管多采集1管血液。采集完成后退出采血管，轻轻颠倒混匀8~10次，让血液和稳定剂达到充分混合的状态。
3.2. 样本处理
采集样本送至第三方检测平台待处理，样本均4℃保存，A患者4种品牌采血管内样本及B、C、D、E第三方提供采血管样本送达检验机构立即进行样本的提取测序工作，B患者4种品牌采血管内样本保存3 d进行样本提取测序，C患者4种品牌采血管内样本保存7d进行样本提取测序，D患者4种品牌采血管内样本保存10 d进行样本提取测序，E患者4种品牌采血管内样本保存14 d进行样本提取测序，根据二代测序结果判断采血管对样本保存效果(结果见表2)。
Table 2. Clinical application of mutation gene test results in cancer patients
表2. 肿瘤患者临床应用变异基因检测结果
4. 结果
4.1. q-PCR定量结果(ct值)
将志愿者血液采集到采血管后，保存至设置时间点进行cf-DNA提取，并进行q-PCR荧光定量检测采血管对cf-DNA保存效果，q-PCR相对定量ct值曲线变化趋势呈水平线，对保存3 d、7 d、10 d、14 d后提取cf-DNA进行定量ct值与保存0~2 h提取cf-DNA进行定量ct值差值均小于1，表明驼人自主研发采血管保存血浆cf-DNA效果与市售其他品牌采血管保存效果达到同一水平。
4.2. 二代测序结果
肿瘤患者血液样本在采血管中保存后，采用二代测序技术检测变异基因，五位患者检测结果一致，经保存后的肿瘤患者cf-DNA未出现稳定剂导致基因突变及不可检测现象，从而导致检测结果有误影响医生指导用药。且C、D、E患者样本保存时间分别在7 d、10 d、14 d，检测结果与保存在第三方采血管3天内完成cf-DNA提取检测结果保持一致。
结合3.1及3.2结果，驼人采血管，I采血管，II采血管均可稳定保存cf-DNA长达14 d。
5. 讨论
cf-DNA作为新的生物标志物，其水平和组分的稳定性对后期的临床检测至关重要，为保证样本在从医院收集到第三方检测平台进行处理和检验所需时间内样本内cf-DNA能够稳定保存，即不降解，不受细胞基因组DNA污染，且添加稳定剂对其无致突变影响，开发出的采血管需具备功能有：保持血液细胞完整同时可抑制其生命代谢活动，保证无基因组DNA释放到血浆中，同时可使血浆中cf-DNA保持最初水平无降解，且添加剂对cf-DNA无致突变作用 [14] [15] [16]。
本文对比了驼人采血管，I采血管，II采血管对样本保存能力，将健康志愿者血液采集到采血管后，保存至设置时间点进行cf-DNA提取，并进行q-PCR荧光定量检测采血管对cf-DNA保存效果，q-PCR相对定量ct值曲线变化趋势呈水平线。对保存3 d、7 d、10 d、14 d后提取cf-DNA进行定量ct值与保存0~2 h提取cf-DNA进行定量ct值差值均小于1，说明三种采血管对样本保存，既保护血细胞完整抑制其代谢，又达到稳定血浆cf-DNA不降解功能，将肿瘤患者血液样本在采血管中保存后，采用二代测序技术检测变异基因，五位患者检测结果一致则说明采血管添加剂无致突变作用。
6. 结论
综上所述，经驼人自主研发游离DNA保存管具备稳定保存cf-DNA功能，保持血液细胞完整同时可抑制其生命代谢活动，保证无基因组DNA释放到血浆中，同时可使血浆中cf-DNA保持最初水平无降解，且添加剂对cf-DNA无致突变作用。