1. 引言
脑卒中是多种原因导致脑血管受损的疾病，其中以缺血性脑卒中为主，发病率逐年增高，由于其具有较高的致残率和复发率，给社会和家庭带来沉重的负担 [1]。脑卒中后肢体痉挛是脑卒中常见的并发症，严重影响脑卒中患者偏瘫肢体的活动能力，影响功能恢复。目前脑卒中后痉挛性瘫痪的治疗主要有药物、针灸、推拿、手术、康复治疗等 [2]。中医药疗法在脑卒中后肢体痉挛的治疗中具有独特的优势，得到了广泛的应用。
栝楼桂枝汤是张仲景《金匮要略》中用于治疗外感热病引起的痉挛及内伤杂病中出现的抽搐、发痉、手足孺动等症的经典方：“太阳病，其证备，身体强，几几然，脉反沉迟，此为痉，栝楼桂枝汤主之”，方药由栝楼根，桂枝，白芍，甘草，生姜，大枣组成，具有调和阴阳气血，柔润筋脉，养营生津的功效 [3]。目前已被批准为福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂，用于治疗脑卒中后肢体痉挛。课题组前期研究发现该方可显著改善脑缺血大鼠肢体功能，促进缺血脑组织神经再生及突触生长 [4]。本文采用Micro-PET活体成像方法，检测栝楼桂枝汤对脑缺血后脑组织葡萄糖代谢的作用及其与葡萄糖转运体-1 (glucose transporter 1, Glut-1)相关的可能机制。
2. 材料与方法
2.1. 动物
SD大鼠，雄性，280~300 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(许可证号SCXK (沪) 2019-0002)，光暗周期12/12 h (光照时间8:00~20:00)下饲养，自由饮食。
2.2. 药品及试剂
天花粉、桂枝、芍药、甘草、生姜、大枣颗粒剂购自北京康仁堂药业有限公司。兔抗Glut-1抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司(GB11215)。MaxVision免疫组化试剂盒及DAB显色试剂为福州迈新生物技术公司产品，免疫染色稀释液为碧云天生物技术公司产品。MCAO线栓购自广州佳灵生物技术公司。其余试剂为国产分析纯。
2.3. 方法
2.3.1. 大鼠大脑中动脉栓塞/再灌注模型
按照课题组前期研究方法制作大脑中动脉闭塞/再灌注模型，SD大鼠在异氟烷麻醉下进行手术。大鼠取仰卧位，行颈部正中切口，分离右侧颈总动脉(common carotidartery, CCA)、颈外动脉(external carotidartery, ECA)和颈内动脉(internal carotid artery, ICA)。凝断ECA的分支动脉，结扎远心端。暂时夹闭CCA和ICA，在ECA距离CCA分叉3mm处剪一个小口，将MCAO线栓经ECA插入ICA，当进线遇轻微阻力时停止，此时线栓头端距CCA分叉处约18 mm，栓线头部进入颅内的大脑中动脉(MCA)开口处，制成MCAO模型。线栓缺血2小时后，再次以异氟烷麻醉动物，拔出线栓。假手术组除不在颈内动脉插入线栓外，其余步骤相同。
模型制作后按Longa神经功能缺失5分制评分标准进行神经功能评分，评1~3分者为模型成功纳入标准。评分标准：0分：无明显神经缺损症状，活动正常；1分：提尾悬空时不能完全伸展左侧前爪；2分：行走时身体向偏瘫的左侧转圈，即追尾征；3分：行走时向偏瘫的左侧倾倒；4分：不能自发行走或清醒障碍。
2.3.2. 动物分组及给药
大鼠随机分为假手术组、模型组和栝楼桂枝汤组，按前述方法造模，除假手术组动物外，所有进行过MCAO手术的动物依据其造模后的神经功能评分随机分为模型组和栝楼桂枝汤给药组，给药组动物每日一次给予灌胃栝楼桂枝汤，模型组和假手术组给予等体积生理盐水，连续给药14天。
栝楼桂枝汤由天花粉30 g，桂枝9 g，白芍9 g，甘草6 g，生姜9 g，大枣9 g组成，采用各药的标准颗粒剂在100℃沸水浴中冲泡混合作用30分钟而成。每1剂标准颗粒剂溶解于120 mL沸水中，大鼠的给药剂量为每kg体重10 mL，该剂量相当于生药量6 g/kg，为成人临床剂量的5倍。
2.3.3. Micro-PET活体影像检测方法
SD大鼠放在麻醉盒中，在3 L/min的氧气流速下利用3%异氟烷进行预麻醉，然后尾静脉注射0.2 mL (37 Mbq) 18F-FDG标记探针，吸收40 min之后，放入Siemens Inveon Micro PET/CT设备扫描床进行扫描显影，PET/CT设备分辨率为1.5 mm，单个床位孔径5.7 cm，轴向8.5 cm视野(Field of view, FOV)。大鼠俯卧位固定于扫描床位FOV的中心位置，并处于2 L/min的1.5%异氟烷持续麻醉中。CT (视野：8.5 cm × 5.7 cm)扫描5 min后再进行10 min的PET数据采集，CT数据用于衰减矫正和图像的解剖学描绘。
应用Inveon Research Workplace软件进行图像分析。基于PET/CT融合图像，在CT图像的指导下手动画出感兴趣区域(regions of interest, ROI)，对脑部的示踪剂吸收值进行定量，并计算出平均标准摄取值(standard uptake value, SUV)，缺血后造影剂摄取量降低，通过阈值设置软件自动勾画吸收值低的区域从而统计出低摄取区域体积大小。
2.3.4. 免疫组织化学染色及图像分析
各组取5只大鼠，缺血再灌注7天后，以10%水合氯醛(3 mL/kg, i.p.)麻醉大鼠，经心脏灌注生理盐水快速冲洗全身血液，然后缓慢灌入含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸钠缓冲液(PB)至大鼠身体僵硬。然后剥离鼠脑，依次置于含20%蔗糖的多聚甲醛固定液和含30%蔗糖的0.1 M磷酸钠缓冲液至标本沉底。在冰冻切片机上制备30 μm厚冰冻冠状切片，参照大鼠脑立体定位图谱，选取冠状面位于前囟前1.7~1.0 mm (纹状体)的冠状脑切片，收集于含30%蔗糖、30%乙二醇的0.05 M磷酸钠缓冲盐溶液(PBS)，置−20℃保存至测定。免疫组织化学采用即用型快捷免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒进行，切片经0.01 M PBS液充分漂洗3次，在含3% H2O2的0.01 M PBS液中室温孵育10 min以去除内源性过氧化物酶，在兔抗Glut-1抗体(1:100)中4℃孵育过夜，然后在酶标聚合物中室温孵育15 min。每一步孵育后均以0.01 M PBS液充分漂洗3次。最后切片用DAB显色试剂盒显色5~10 min。显色后切片漂洗，裱于载玻片上，常规脱水、透明、中性树胶封片。光镜下观察并拍照。免疫组化对照实验是在省略一抗其余步骤同上情况下进行，结果为阴性。
2.3.5. 统计分析
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据以
± s的形式给出。组间比较采用单因素方差分析及LSD-t进行两两比较，以p < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 栝楼桂枝汤改善大鼠脑缺血区域葡萄糖代谢水平
大鼠MCAO手术造成脑缺血再灌注损伤后，采用栝楼桂枝汤灌胃干预，各组随机选取3只大鼠，进行纹状体及周边区域葡萄糖代谢水平比较。经检测，发现假手术组大鼠脑组织结构完整，未发现18F-FDG标记物摄取降低的区域。MCAO手术造模后，纹状体及周边区域18F-FDG标记物摄取值显著降低，随着缺血时间推移，至缺血后7天、14天，脑组织造影剂低摄取区域体积有所降低。大鼠脑缺血手术后给予栝楼桂枝汤治疗，脑组织造影剂18F-FDG低摄取区域在缺血后7天、14天较模型组显著降低(见图1)，表明栝楼桂枝汤对脑缺血损伤后脑细胞的葡萄糖摄取有显著的提升作用。
注：与假手术组比较，#：p < 0.01；与模型组比较，*：p < 0.05；Sham：假手术组；Vehicle：模型组；GLGZD：栝楼桂枝颗粒给药组；各组n = 3。
Figure 1. Effect of GLGZD on uptake of 18F-FDG in MCAO rats
图1. 栝楼桂枝汤对MCAO大鼠18F-FDG摄取的作用
3.2. 栝楼桂枝汤对脑缺血区域Glut-1表达的作用
免疫组织化学染色结果显示，假手术组纹状体缺血周边区域仅有少量Glut-1阳性染色表达，模型组Glut-1阳性染色显著高于假手术组，阳性细胞数量增多(见表1，p < 0.05)，栝楼桂枝汤治疗组Glut-1阳性染色较模型组显著升高(见表1，p < 0.05)。
Table 1. Effect of GLGZD on Glut-1 expression in striatum of MCAO rats
表1. 栝楼桂枝汤对MCAO大鼠纹状体Glut-1表达的作用
注：与假手术组比较，#：p < 0.05；与模型组比较，*：p < 0.05。
4. 讨论
正电子发射型计算机断层扫描(position emission tomography, PET)成像是将发射正电子的放射性核素(如18F、11C、13N、15O等)标记在具有生物学效应的配体分子上，用于对体内新陈代谢和生理功能的成像。由于它是一种功能成像，能够用于研究引起疾病的根本生理过程和分子异常表达情况。葡萄糖是人体三大能源物质之一，将可以被PET探测并形成影像的正电子核素18F标记在葡萄糖上，即18F-脱氧葡萄糖(18F-FDG)，可准确反映体内器官/组织的葡萄糖代谢水平，是目前PET-CT显像的主要显像剂 [5]。通过对大鼠脑组织18F-FDG糖代谢功能进行测定，可以在活体上显示脑缺血后脑组织葡萄糖代谢的动态变化。
糖酵解是脑缺血后脑组织利用能量的主要形式，脑缺血后神经元存活的关键因素在于是否能有效利用葡萄糖提供能量 [6]。脑组织葡萄糖由细胞膜上的葡萄糖转运体(glucose transporter 1, Glut-1)进行转运，其表达量反映组织对葡萄糖的代谢。本文采用PET-CT分子成像技术观测栝楼桂枝汤治疗缺血性脑卒中的疗效，结果表明，大鼠脑缺血损伤后，脑内出现明显的葡萄糖低摄取区域，表明缺血造成神经细胞活性降低，葡萄糖摄取下降，栝楼桂枝汤可显著降低脑组织造影剂18F-FDG低摄取区域，表明该方可增加脑缺血后神经细胞对葡萄糖的摄取利用。进一步研究发现，脑缺血后脑组织Glut-1表达有所升高，这可能是脑组织对缺血的适应性反应，增加组织的葡萄糖转运以供给更多的能量。栝楼桂枝汤治疗可显著升高Glut-1的表达，表明该方可能是通过增加葡萄糖转运体改善脑组织葡萄糖摄取。
栝楼桂枝汤是中医用以缓解太阳病“痉症”的经典方，目前临床用于治疗脑卒中后肢体痉挛已有许多报道 [7] [8]。前期研究关于栝楼桂枝汤治疗脑卒中的药理机制研究发现，该方在氧化应激及谷氨酸损伤的细胞模型和脑缺血再灌注大鼠模型上都可表现出明确的神经保护作用 [9] [10] [11] [12]，其机制可能涉及调控脑组织兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸的平衡 [13] [14] [15]，抗炎 [16]、抗凋亡 [17]、抗氧化 [18] 等途径。本研究结果表明，栝楼桂枝汤对脑缺血后葡萄糖代谢具有促进作用，为该方用于脑卒中后遗症的临床应用提供了更多的实验依据。
基金项目
本研究得到国家自然科学基金项目(81803870)；福建省自然科学基金项目(2018J01855)；福建省属公益类科研院所基本科研专项项目(2019R1003-2)的资助。