1. 引言
真菌性角膜炎是一种常见的感染性眼病，其病因因地理位置、社会经济和环境气候而异 [1]。据报道，真菌性角膜炎的致病菌有100余种，其中以曲霉菌属和镰刀菌属最为常见 [2]。与细菌性角膜炎相比，真菌性角膜炎的病程更长，预后较差，常遗留永久性视力损害，甚至眼球摘除。在亚洲地区，真菌性角膜炎约占传染性角膜炎的一半，是导致失明的主要原因之一。真菌性角膜炎的患者常有不同程度的视力下降、眼红、流泪、疼痛和分泌物产生，严重影响患者的生活质量。随着植物性眼外伤的发生及隐形眼镜佩戴人数的增加 [3]，真菌性角膜炎的发病率持续增高。据统计，全球每年有大约一百万例新发感染 [4]，带来了沉重的社会经济负担。目前，局部使用抗真菌药物是真菌性角膜炎的一线治疗方式。
病原体侵入角膜组织后，角膜上皮细胞及巨噬细胞通过模式识别受体检测到病原体相关分子模式，激活局部的先天免疫反应，导致大量炎性因子、趋化因子产生及炎症细胞聚集。其中，活化的中性粒细胞通过产生活性氧、释放各种酶来杀灭病原体 [5]。然而，过度的炎症反应及氧化应激在杀灭真菌的同时，对角膜组织产生了严重的破坏，是引起永久性视力损害的重要原因 [6]。因此，单纯的抗真菌治疗无法取得满意的治疗效果。
丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是由丁香类植物中提取的一种苯丙烷类化合物，已被广泛用于口腔医学 [7]、食品或化妆品的调味剂、防腐剂 [8]。大量研究表明，丁香酚具有抗炎、抗氧化、抗微生物、麻醉、镇痛等药理作用 [9] [10] [11] [12]。有研究表明，在LPS诱导的小鼠急性肺损伤反应模型中，丁香酚通过抑制NF-κB信号通路降低小鼠肺组织中IL-6、TNF-α的表达，抑制中性粒细胞的聚集，并增加抗氧化剂(SOD1, CAT, Gpx1, GST)的表达 [13]。此外，丁香酚还可以抑制LPS诱导的巨噬细胞中IL-1β、TNF-α、iNOS的表达增高，其抗炎作用可能与NF-κB、ERK1/2及P38MAPK信号通路的抑制有关 [14]。但是，丁香酚是否能够在烟曲霉菌性角膜炎中发挥保护作用仍是未知的。本实验研究了丁香酚在烟曲霉菌感染的小鼠角膜和腹腔巨噬细胞中的抗炎、抗氧化作用，旨在为真菌性角膜炎的治疗提供新的思路。
2. 材料与方法
2.1. 实验物品及试剂
2.1.1. 实验动物
SPF级C57BL/6小鼠(雌性，8周龄)购买自北京斯贝福生物中心。实验动物的使用符合中国科学技术部实验动物的人道待遇指导要求及美国眼科和视觉研究协会(ARVO)关于动物的使用规定，该实验已通过医院伦理委员会批准。
2.1.2. 实验细胞
按说明书制备硫代乙醇液体培养基，高压蒸汽灭菌15分钟，并在室温下冷却，将冷却后的硫代乙醇培养基注入小鼠腹腔(1 ml/只)，充分按摩腹部。1周后颈椎脱臼法处死小鼠，使用一次性注射器向小鼠腹腔内注入5 ml DMEM培养液，充分按摩腹腔后将腹腔内液体吸出。将吸出的液体离心10分钟(4℃，1200 rpm)，弃上清液，离心管内加入适量含有10% FBS的培养液重悬细胞，将细胞悬液转移至12孔细胞培养板中继续培养。
2.1.3. 实验菌种
烟曲霉菌菌株3.0772购买自中国国家微生物收藏中心。
2.1.4. 实验试剂
丁香酚(上海MCE公司)、RNAiso Plus (大连TaKaRa公司)、HiScript III RT (南京诺唯赞公司)、SYBR (南京诺唯赞公司)，DCFH-DA荧光探针(上海MCE公司)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 烟曲霉菌的培养与制备
将烟曲霉菌孢子孵育于液体沙氏培养基中，并置于恒温培养箱中，37℃ 120 rpm，培养至菌丝生成。收集菌丝，使用预消毒的玻璃研磨棒将菌丝研磨至20~40 μm长的细小片段，4000 g离心30分钟。离心后的菌丝浸泡于75%的乙醇中过夜灭活。次日，使用无菌PBS充分洗涤菌丝，离心(4000 g，20分钟)，弃上清液，使用DMEM培养液调整菌丝浓度至1 × 108 CFU/ML。
2.2.2. 灭活菌丝刺激腹腔巨噬细胞
12孔板内的巨噬细胞分为6组：正常组(N组)、DMSO对照组(DMSO组)、丁香酚对照组(EUG组)、加菌组(AF组)、加菌加DMSO组(AF + DMSO组)、加菌加丁香酚组(AF + EUG组)。细胞贴壁后，吸出培养液，使用无菌PBS冲洗3遍，随后向细胞培养板中加入含有160 μg/mL丁香酚或0.05% DMSO的新鲜培养液预处理细胞2小时。随后各孔加入50 μl灭活的烟曲霉菌菌丝，置于恒温培养箱内孵育8小时(37℃，5% CO2)。
2.2.3. 烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型的建立与处理
使用8%水合氯醛对C57BL/6小鼠进行腹腔麻醉，将麻醉后的小鼠置于无菌操作台上。在显微镜下使用无菌手术刀片刮除小鼠右眼角膜上皮，半径约2 mm，在上皮缺损处做深达中部基质层的划痕，并在角膜损伤处涂抹烟曲霉菌菌丝，随后覆盖角膜接触镜并缝合眼睑。左眼不做处理。次日，拆除眼睑缝线，分别使用160 μg/mL丁香酚或0.05% DMSO溶液对小鼠点眼处理，每日3次。感染后第1天、第5天，在眼科裂隙灯下观察小鼠角膜情况，并拍照记录。小鼠角膜炎症分级标准见表1。
Table 1. Inflammation grade of mouse fungal keratitis model
表1. 小鼠真菌性角膜炎模型炎症分级
2.2.4. 实时荧光定量PCR
1) RNA的提取、含量及纯度测定
吸除腹腔巨噬细胞培养板中的培养液，无菌PBS冲洗3遍，每孔中加入500 μl的RNAiso Plus试剂，收集细胞转移至ep管中，随后置于至冰盒裂解30分钟。颈椎脱臼法处死小鼠后，取角膜组织置于ep管中，并在管内加入500 μl的RNAiso Plus试剂，使用超声细胞破碎仪破碎角膜组织，并置于冰盒裂解2小时。样本充分裂解后，离心(4℃, 12,000 rpm) 10分钟，提取上清液至新ep管中。管内加入100 μl氯仿，振荡混匀，离心(4℃, 12,000 rpm) 15分钟，提取上清液至新ep管中。管内加入等体积的异丙醇，振荡混匀，静置10分钟后离心(条件同上)，弃上清液，75%乙醇洗涤RNA沉淀。重复振荡混匀，离心10分钟后弃上清液，ep管于室温下干燥，待管内液体完全蒸发后，加入适量DEPC水溶解沉淀，移液枪充分吹打混匀，立即使用酶标仪测定RNA浓度及纯度。
2) 逆转录
按照产品使用说明，使用HiScript III RT试剂将RNA样本逆转录合成cDNA样本。
3) PCR
按照产品使用说明，使用SYBR试剂盒制备PCR反应体系，见表2。以β-actin为内参，使用Roche PCR仪完成PCR扩增反应，具体反应条件为：预变性(95℃, 30 s)→变性(95℃, 45 s; 60℃, 30 s)→退火、延伸(95℃, 15 s; 60℃, 30 s)→溶解(95℃, 15 s)。相应PCR引物序列见表3。
2.2.5. 巨噬细胞内ROS含量的测量
巨噬细胞接种于96孔板，使用含有160 μg/mL丁香酚或0.05% DMSO的培养液预处理2小时。加入灭活菌丝后，分别在第0、1、2、4、8、16、24小时加入DCFH-DA探针孵育20分钟，PBS洗涤3次，使用分光光度计以488 nm激发波长、525 nm发射波长测定荧光强度。
2.3. 统计学分析
使用GraphPad Prism 8对实验数据进行分析。两组间比较使用未配对双尾t检验，多组比较使用One-way ANOVA检验。P < 0.05认为具有统计学意义。实验数据以x ± s表示。
3. 结果
3.1. 丁香酚抑制腹腔巨噬细胞中炎症因子及模式识别受体TLR2的表达
PCR结果显示，加入灭活的烟曲霉菌菌丝8小时后，小鼠腹腔巨噬细胞中IL-1β (图1(A))、TNF-α (图1(B))、IL-10 (图1(C))、iNOS (图1(D))等炎症因子的mRNA表达较正常组明显增高，而丁香酚预处理显著抑制了以上炎症因子的表达，差异具有统计学意义。此外，烟曲霉菌菌丝刺激的巨噬细胞中，模式识别受体TLR2 (图1(E))的mRNA表达水平明显增高，丁香酚预处理显著降低了TLR2的表达，差异具有统计学意义。
注：(A)~(D) 灭活的烟曲霉菌菌丝刺激小鼠腹腔巨噬细胞，EUG预处理组的细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10、iNOS的mRNA表达较DMSO处理组降低；(E) EUG预处理组的模式识别受体TLR2的表达较DMSO组降低(n = 6/组)。
Figure 1. EUG inhibited the expressions of pro-inflammatory cytokines and TLR2 in A. fumigatus-stimulated macrophages
图1. 丁香酚抑制烟曲霉菌刺激的腹腔巨噬细胞中炎症因子及模式识别受体TLR2的表达
3.2. 丁香酚抑制腹腔巨噬细胞中ROS的产生
为探讨丁香酚对氧化应激的作用，我们使用DCFH-DA探针检测巨噬细胞中ROS的表达水平。结果(图2)显示，加入灭活的烟曲霉菌菌丝后，细胞中ROS的表达量自第1小时开始上升，于4小时后达高峰，至第24小时仍高于正常水平。与对照组相比，在加入灭活菌丝后第1、2、4、8、16和24小时，丁香酚处理的巨噬细胞中ROS的表达量均下降。
注：灭活的烟曲霉菌菌丝刺激小鼠腹腔巨噬细胞，分别在第0、1、2、4、8、16、24小时检测细胞中ROS含量，与DMSO组相比，EUG预处理组的细胞中ROS表达显著降低(n = 6/组) (***p < 0.001)。
Figure 2. Eugenol inhibited the expression of ROS in A. fumigatus-stimulated macrophages
图2. 丁香酚抑制腹腔巨噬细胞中ROS的产生
3.3. 丁香酚改善小鼠真菌性角膜炎的严重程度
建立真菌性角膜炎小鼠模型，分别使用DMSO及丁香酚处理5天后，使用裂隙灯进行角膜拍照并摘取角膜行HE染色。结果显示，在真菌感染5天后，DMSO处理的小鼠角膜(图3(A))溃疡面积较大，角膜水肿较重；丁香酚处理的小鼠角膜(图3(B))溃疡面积较对照组减小，角膜水肿减轻。经丁香酚处理的小鼠角膜炎症评分较对照组明显降低(图3(C))。角膜组织切片的HE染色显示，丁香酚处理的角膜(图3(E))中炎症细胞浸润程度较DMSO组(图3(D))明显减轻。以上结果表明，丁香酚显著减轻了小鼠角膜炎的严重程度。
注：(A) 感染后第5天，DMSO处理的小鼠角膜的代表性裂隙灯照片；(B) 感染后第5天，EUG处理的小鼠角膜的代表性裂隙灯照片；(C) 用DMSO或EUG处理的小鼠角膜炎症评分；(D) 感染后第5天，DMSO处理的小鼠角膜的代表性HE染色图像；(E) 感染后第5天，EUG处理的小鼠角膜的代表性HE染色图像(n = 6/组)。
Figure 3. Eugenol treatment alleviates the severity of mouse A. fumigatus keratitis
图3. 丁香酚改善小鼠真菌性角膜炎的严重程度
3.4. 丁香酚抑制烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜中炎症因子及TLR2的表达
建立真菌性角膜炎小鼠模型，分别使用DMSO及丁香酚处理5天后，收集小鼠角膜并测定角膜中炎症因子及模式识别受体TLR2的mRNA表达水平。结果显示，在感染5天后，丁香酚处理的小鼠角膜中炎症因子IL-1β (图4(A))、TNF-α (图4(B))、iNOS (图4(C))的表达较DMSO处理组明显降低，差异具有统计学意义。此外，丁香酚显著抑制了烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜中模式识别受体TLR2 (图4(D))的mRNA表达。
注：(A)~(D) 烟曲霉菌感染小鼠角膜后第5天，与DMSO组相比，EUG处理组小鼠角膜中IL-1β、TNF-α、iNOS、TLR2的表达显著降低(n = 6/组)。
Figure 4. Eugenol inhibited the expressions of inflammatory factors and TLR2 in mice A. fumigatus keratitis
图4. 丁香酚抑制烟曲霉菌性角膜炎小鼠角膜中炎症因子及TLR2的表达
4. 讨论
真菌性角膜炎是一种常见的角膜感染，严重影响视力，甚至导致眼球摘除。在真菌性角膜炎的发展过程中，角膜组织内大量炎症介质生成、模式识别受体激活，激发免疫介导的炎症反应和氧化应激。过度的炎症反应和氧化应激对角膜组织产生了严重的破坏，是导致永久性视力损伤的重要原因，单纯的抗真菌治疗无法达到理想的治疗效果。
丁香酚是由丁香类植物中提取的植物活性成分，已被报道具有很好的抗炎、抗氧化、抗感染等活性。不仅如此，研究表明丁香酚与标准抗真菌药物联合使用，可以在减轻炎症反应的同时，减少抗真菌药的用药剂量、最大限度的减少不良反应，改善疾病的预后 [15] [16]。在本实验研究中，丁香酚有效减轻了真菌性角膜炎小鼠角膜中炎症细胞的浸润程度，并抑制角膜中炎症因子(IL-1β、TNF-α、iNOS)、腹腔巨噬细胞中炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-10、iNOS)的表达，表明丁香酚具有一定的抗炎作用。有研究表明，在小鼠胰腺炎模型中，丁香酚有效抑制了IL-1β和TNF-α等炎症因子的表达 [17]，这与我们的实验结果一致。不仅如此，丁香酚显著减少了烟曲霉菌刺激引起的巨噬细胞中活性氧的产生，表明丁香酚具有一定的抗氧化作用。
先天免疫是宿主抵御病原微生物的第一道防线。模式识别受体(如Toll样受体、C型凝集素受体等)是先天免疫的重要组成成分，负责识别病原体中的病原体相关分子模式，并介导中性粒细胞的聚集、趋化因子的产生，促进炎症反应 [18]。Toll样受体是一种重要的模式识别受体，在巨噬细胞抗真菌反应中发挥重要作用 [19]。我们的研究结果显示，烟曲霉菌刺激可引起腹腔巨噬细胞中TLR2的表达增高。与DMSO对照组相比，丁香酚预处理可显著抑制TLR2的表达增高。不仅如此，在小鼠角膜炎模型中，在感染后第五天，丁香酚处理的角膜中TLR2的表达较对照组明显下降。这提示丁香酚对炎症因子表达的抑制作用可能与下调模式识别受体TLR2的表达有关。
综上所述，丁香酚可以改善烟曲霉菌性小鼠角膜炎的严重程度，抑制烟曲霉菌感染的小鼠角膜中炎症因子、模式识别受体TLR2的表达，减轻炎症细胞的浸润；减少烟曲霉菌刺激的巨噬细胞中炎症因子、TLR2的表达及ROS的产生。以上结果表明，丁香酚可以在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中发挥抗炎、抗氧化的作用，其作用在小鼠模型和巨噬细胞实验中均得到证实，表明丁香酚有望成为真菌性角膜炎抗炎治疗的新型药物；丁香酚的抗炎作用可能与下调TLR2的表达有关，但其具体机制有待进一步研究。
NOTES
*通讯作者Email: yankelicui@126.com