CRISPR/Cas9和λ-Red基因敲除技术在大肠杆菌中的应用比较

Comparative Study of CRISPR/Cas9 and λ-Red Gene Knockout Techniques in Eschrichia coli

摘要: λ-Red和CRISPR/Cas9基因敲除技术已被广泛应用于染色体基因敲除。本研究分别采用λ-Red和CRISPR/Cas9技术对大肠杆菌BL21菌株染色体丙氨酸消旋酶基因alr进行了敲除，并比较了其敲除效率。对于Red敲除技术而言，首先构建由alr上下游同源臂和卡那抗性盒FLT-kan^R-FLT组成的打靶片段Lalr-FLT-kan^R-FLT-Ralr，转化E. coli BL21/pKD46感受态细胞，在pKD46表达的Red重组酶作用下发生同源重组，使染色体alr被卡那抗性盒FLT-kan^R-FLT替换；然后，质粒pCP20转化上述发生了alr替换的E. coli菌株感受态细胞，在pCP20表达的FLP重组酶作用下发生位点特异性重组，删除卡那抗性基因kan^R；最后，对温敏型质粒进行消除，获得alr敲除突变株E. coli BL21 Δalr-Red。对于CRISPR/Cas9技术而言，首先构建敲除质粒pTargetF-alr，制备打靶供体DNA片段L-alr-R；接着，pTargetF-alr和L-alr-R共转化E. coli BL21/pCas感受态细胞，在pTargetF-alr编码的sgRNA序列引导下，质粒pCas编码的Cas9蛋白结合到alr基因切割靶点DNA，通过对双链断裂的同源重组修复实现对alr基因的无痕敲除，获得alr敲除突变株E. coli BL21 Δalr-CRISPR。实验结果显示：使用基于短、长同源臂靶打靶片段的Red技术，E. coli BL21 Δalr-Red阳性转化子检出率分别为5%和55%；而使用CRISPR/Cas技术，E. coli BL21 Δalr-CRISPR阳性转化子检出率为95%。实验结果表明：在E. coli中，使用短同源臂靶打靶片段的Red敲除技术，转化子脱靶率超高，这使阳性转化子鉴定工作量大增；使用长同源臂打靶片段的Red敲除技术，较为容易检测到阳性转化子；使用CRISPR/Cas9技术，敲除效率显著优于λ-Red技术。

Abstract: CRISPR/Cas9 and λ-Red techniques have been wildly used for chromosomal gene knockout. In this study, the alanine racemase gene alr on the genome of Escherichia coli BL21 strain was deleted using the two gene knockout methods, respectively, and the efficiencies of knockout were compared. For λ-Red technique, firstly, the targeting fragments Lalr-FLT-kan^R-FLT-Ralr consisting of the upstream and downstream homologous arms of the gene alr and the kanamycin-resistant cassette FLT-kan^R-FLT were prepared, transformed into the E. coli BL21/pKD46 competent cells, and chromosomal alr was replaced by FLT-kan^R-FLT by pKD46-Red enzymes-mediated homologous recombination; secondly, kan^R was deleted by pCP20-FLP enzyme-mediated site-specific recombination; finally, temperature-sensitive plasmids were eliminated, generating the mutant strain E. coli BL21 Δalr-Red. For CRISPR/Cas9 technique, firstly, knockout plasmid pTargetF-alr was constructed and targeting donor fragment L-alr-R was prepared; secondly, pTargetF-alr and L-alr-R were co-transformed into the E. coli BL21/pCas competent cells; scarless knockout of alr was achieved by cleavage of alr by sgRNA guiding-Cas9 protein and sequential double strands breakage repair based on homologous recombination, generating the mutant strain E. coli BL21 Δalr-CRISPR. The experimental results showed that the rates of the E. coli BL21 Δalr-Red positive transformants were 5% and 55% using short homologous arms and long homologous arms λ-Red techniques, respectively, while the rate of the E. coli BL21 Δalr-CRISPR positive transformants was 95% using CRISPR/Cas9 techniques. These results demonstrate that in E. coli, short homologous arms λ-Red technique leads to a superhigh off-target rate of transformants, which would increase work intensity for positive transformants screening; positive transformants are relatively easy to obtain using long homologous arms λ-Red technique; the knockout rate of CRISPR/Cas9 technique is significantly higher than that of λ-Red technique.

1. 引言

基因敲除技术的发展源于20世纪80年代末期分子生物学的进步，其中基于细菌RecA重组酶的基因敲除系统是最为传统的技术手段 [1]。RecA基因敲除技术主要利用细菌内源性同源重组酶RecA蛋白和RecBCD蛋白复合体来对基因进行编辑 [2]，其必须通过体外酶切连接等操作将带有待敲除序列两翼同源臂序列构建到环状质粒或BAC载体上，目前，人们已经很少使用这种复杂的技术来对目的基因进行敲除 [3]。更为高效基因敲除技术，如λ-Red和CRISPR/Cas基因敲除技术，已经被广泛用于生物体遗传改造 [4]。

λ-Red重组技术源于λ-噬菌体Red基因座表达的Exo、Beta、Gam三个功能蛋白，其能介导基因组序列与外源供体DNA发生同源重组。Exo是一种双功能蛋白，其主要功能是作为核酸外切酶自5′端降解DNA，其次是作为重组酶直接促使基因重组；Beta蛋白功能是作为单链结合蛋白保护来3′突出端，介导已经完成互补链的退火；Gam蛋白功能主要是作为阻遏蛋白来防止外源DNA被内源性核酸酶降解 [5]。

CRISPR/Cas系统产生于细菌在进化过程中对外源物种入侵的适应性免疫反应 [6]。自1987年科学家在分析大肠杆菌(Eschrichia coli)基因组时发现带有重复的有间隔的序列开始，至今CRISPR/Cas技术发展全面突破，CRISPR/Cas9成为其中研究最为透彻和主流的技术 [7]。Cas9主要来源于酿脓链球菌，该系统发挥作用首先需要CRISPR基因座上游的trans-activating RNA (tracrRNA)表达，其与Cas9共同参加CRIPSR-derived RNA (crRNA)的成熟，成熟的crRNA与tracrRNA形成gRNA [8]。Cas9蛋白携带gRNA与DNA序列扫描比对，如果靶DNA与gRNA携带的crRNA序列一致，则DNA将被“扣留”，tracrRNA激活Cas9切断这条DNA，而达到敲除该DNA的效果 [9]。

丙氨酸消旋酶参与E. coli细胞壁合成，研究表明丙氨酸消旋酶基因的失活会导致E. coli无法正常合成细胞壁而导致死亡 [10]。E. coli丙氨酸消旋酶基因分两种类型：组成型基因alr和诱导表达型基因dadx。其中alr可以稳定地为细胞提供大量充足的D-丙氨酸，而dadX主要受到L-丙氨酸诱导调控而表达 [11]。丙氨酸消旋酶编码基因可作为互补型筛选标记，用来取代载体抗生素抗性标记，使基因工程表达载体其更适合于大范围使用。E. coli alr基因的敲除，可为构建使用alr作为互补型筛选标记的质粒提供缺陷型宿主。本文拟利用基于不同长度同源修复供体的λ-Red技术和CRISPR/Cas9技术对E. coli丙氨酸消旋酶alr基因进行敲除，并比较不同技术的敲除效率。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 菌株和质粒

本研究所需菌株和质粒信息见表1。

Table 1. Bacterial strains and plasminds used in this study

表1. 本研究所使用的菌株和质粒

2.1.2. 主要试剂

DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(北京天根生化技术有限公司)；DNA聚合酶PrimeSTAR® Max DNA Polymerase、Dpn I限制性内切酶(大连宝生物有限公司)。

2.1.3. 引物序列

本研究所需引物及其序列信息见表2。

Table 2. Primers used in this study

表2. 本研究中所使用的引物

2.2. 应用λ-Red系统敲除E. coli alr基因

2.2.1. 分别携带短、长同源臂的卡那抗性盒打靶片段的扩增

以质粒pKD13为模板，利用引物对P1/P2扩增由alr上下游短同源臂和卡那抗性盒FLT-kan^R-FLT组成的短同源臂打靶片段Lalr-FLT-kan^R-FLT-Ralr。以E. coli BL21基因组DNA为模板，分别利用引物对P5/P6和P9/P10扩增得到alr基因的上下游同源片段；以质粒pKD13为模板，利用引物对P7/P8扩增得到卡那抗性盒片段FLT-kan^R-FLT；利用重叠PCR将这三条线性片段融合成由alr长同源臂及卡那抗性盒FLT-kan^R-FLT组成的打靶片段Lalr-FLT-kan^R-FLT-Ralr。

2.2.2. 电转感受态细胞的制备及转化

将编码含有Red重组系统的pKD46质粒转化进入E. coli BL21中，筛选转化子并将其命名为E. coli BL21/pKD46。将该菌株经30℃过夜培养后，按照1%接种比例转接到含有卡那霉素抗性的LB培养基中，并向其中加入终浓度为50 mM的L-阿拉伯糖。将菌株培养至OD600 = 1.0时停止，以使同源重组酶大量表达而提升敲除效率，并按照Dower [14] 方法进行E. coli BL21/pKD46感受态细胞的制备及转化。

2.2.3. E. coli BL21Δalr-Red敲除菌株的构建

分别取1 ug两种同源臂长度不同打靶片段进行电转化，利用引物对P3/P4鉴定Red重组酶活性下E. coli BL21菌株alr基因是否被替换成两端带有FRT位点的kan^R片段。

通过42℃高温培养可以将alr基因已被kan^R替换的突变株中的温敏型pKD46质粒消除。将表达FLT重组酶活性的氯霉素抗性载体pCP20电转到消除pKD46的突变株中，在FLT重组酶作用进行第二次发生基因交换，进而删除kan^R片段。42℃培养条件下消除温敏型的pCP20质粒，并进行抗性平板验证，敲除突变体命名为E. coli BL21 Δalr-Red。

2.3. 应用CRISPR/Cas9系统敲除E. coli alr基因

2.3.1. sgRNA敲除质粒的构建

通过在线网站(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计出alr基因的gRNA。将设计好的20 bp序列引入到引物alr-N20-F/alr-N20-R中，以pTargetF为模板进行反向PCR，获得带有alr基因sgRNA编码序列的线性pTargetF质粒全长。Dpn I限制性内切酶消除母本质粒，经纯化后转化到E. coli DH5α感受态细胞中进行环化，提质粒并进行测序验证，将正确的质粒命名为pTargetF-alr。

2.3.2. 打靶供体DNA片段的获得

以E. coli BL21基因组DNA为模板，分别利用引物对alr-U-F/alr-U-R和alr-D-F/alr-D-R扩增alr基因上下游同源片段，然后利用重叠PCR将这两条线性片段融合成一条打靶供体DNA片段L-alr-R。

2.3.3. E. coli BL21 Δalr-CRISPR敲除菌株的构建

将含有CRISPR/Cas9重组系统的pCas质粒电转化进入E. coli BL21中，筛选出正确转化子将其命名为E. coli BL21/pCas。E. coli BL21/pCas电转化感受态细胞的制备及转化方法参照2.2.2中所述。

取1 μg供体DNA片段和200 ng pTargetF-alr敲除质粒进行共转化，在sgRNA序列的作用下，Cas9蛋白结合到alr基因特异位点上切割靶DNA，再经同源重组实现对alr基因的敲除，利用引物对alr-JC-F/alr-JC-R对转化子进行PCR验证。

利用IPTG将鉴定正确的菌株进行诱导，使pCas质粒上的sgRNA-pMB1表达，靶向切割pTargetF-alr质粒的pMB1复制子，消除pTargetF-alr质粒。42℃培养条件下消除温敏型pCas质粒，并进行抗性平板验证，敲除突变体命名为E. coli BL21Δalr-CRIPSR。

3. 结果分析

3.1. λ-Red系统构建E. coli alr基因敲除突变株

3.1.1. Red同源打靶片段的获得

引物P1、P2的5′端分别引入了alr基因上下游47 bp的同源臂，以质粒pKD13为模板，扩增两端带有alr基因47 bp短同源臂的打靶片段Lalr-FLT-kan^R-FLT-Ralr。PCR扩增产物长度为1.41 kb，与预期片段长度相符，成功获得短同源臂打靶片段。

以大肠杆菌基因组为模板，分别扩增alr基因上下游长同源臂Lalr (577 bp)和Ralr (539 bp)；以质粒pKD13为模板，扩增仅带有FLP位点的卡那霉素抗性片段FLT-kan^R-FLT (1.34 kb)；进一步，通过重叠PCR将这3个片段融合成长同源臂打靶片段Lalr-FLT-kan^R-FLT-Ralr (2.46 kb)。每一步PCR扩增产物都与预期片段长度相符，成功获得长同源臂打靶片段。

3.1.2. 敲除突变株E. coli BL21 Δalr-Red的构建

λ-Red系统基因敲除流程如下：首先在pKD46质粒所表达Red重组酶作用下，由alr上下游短同源臂和卡那抗性盒FLT-kan^R-FLT组成的打靶片段Lalr-FLT-kan^R-FLT-Ralr与E.coli染色体DNA发生同源重组，FLT-kan^R-FLT替换alr基因；然后在质粒pCP20编码FLP重组酶识别FRT位点，发生位点特异性重组，进一步消除kan^R片段，完成对目的基因的敲除(图1(a))。

两种不同同源臂长度打靶片段电转化E. coli BL21/pKD46感受态细胞，进行基于Red重组酶的同源重组，挑取卡那霉素抗性平板上转化子，利用引物P3/P4进行PCR鉴定。野生型E. coli BL21扩增产物长度为1.64 kb，alr基因被卡那抗性盒FLT-kan^R-FLT替换后的突变株E. coli BL21 Δalr::kan扩增产物长度为2.01 kb，与预期片段长度相符(图1(b))。

将表达FLP重组酶的pCP20质粒电转化至E. coli BL21Δalr::kan感受态细胞中，进行基于FLP重组酶的位点特异性重组，消除卡那霉素抗性基因。挑取转化子，同样利用引物P3/P4进行PCR鉴定。卡那霉素抗性基因消除突变株E. coli BL21 Δalr-Red扩增片段电泳检测结果长度为594 bp，与预期片段长度相符(图1(b))。

(a) (b)注：(a) λ-Red基因敲除技术流程图；(b) 敲除突变株E. coli BL21 Δalr-Red的PCR鉴定。M：DNA marker；1：product of BL21Δalr::kan，2.01 kb；2：product of BL21Δalr-Red，594 bp；3：product of wide type，1.64 kb。

Figure 1. Construction of E. coli BL21 Δalr-Red

图1. 敲除突变株E. coli BL21 Δalr-Red的构建

3.2. CRISPR/Cas9系统构建alr基因敲除株

3.2.1. 同源修复供体DNA的制备

以E. coli BL21基因组DNA为模板，PCR扩增分别获得大肠杆菌alr基因上下游两端同源臂L-alr和R-alr，进一步，通过重叠PCR将这两个片段融合成长同源臂打靶片段L-alr-R (1.06 kb)。每一步PCR扩增产物都与预期片段长度相符，成功获得同源修复供体DNA。

3.2.2. pTargetF-alr的制备

以pTargetF质粒为模板进行反向PCR扩增，获得带有可以靶向定位E. coli BL21基因组DNA alr基因序列的sgRNA编码序列的线性化质粒，经Dpn I限制性内切酶消化母本pTargetF质粒并转化至E. coli DH5α感受态细胞自身环化。测序验证结果表明20 bp的特异打靶序列已成功构建到母本pTargeF质粒上(图2)，打靶质粒pTargetF-alr-sgRNA构建成功。

Figure 2. Identification of the alr targeting sequence by Sanger sequencing

图2. alr基因特异打靶序列测序结果图

3.2.3. 敲除突变株E. coli BL21Δalr-CRISPR的构建

基于双质粒的CRISPR/Cas9敲除系统基因编辑流程如下：首先制备特异性的打靶质粒pTargetF-alr，然后通过pCas9质粒所表达的Cas9蛋白来介导特异sgRNA与目的基因的结合以及剪切，最后断裂双链通过宿主自身同源重组修复进而完成基因的编辑(图3(a))。

将质粒pTargetF-alr与同源修复供体DNA片段共转化至E. coli BL21/pCas感受态细胞中，挑取转化子，利用引物alr-JC-F/alr-JC-R进行PCR鉴定。电泳结果显示PCR扩增产物长度为422 bp，表明alr基因已被成功敲除(图3(b))。进一步，通过42℃培养对温敏型pCas质粒进行消除，最终获得敲除突变株E. coli BL21Δalr-CRISPR。

3.3. CRISPR/Cas9与λ-Red敲除效率比较

统计结果显示，将1 μg短同源臂打靶片段电转化E. coli BL21/pKD46感受态细胞，抗性平板上生长出80个转化子，进一步使用P3/P4引物对转化子作PCR鉴定，结果显示5%的转化子属于alr敲除突变体，其余95%皆为假阳性，属于脱靶抗性转化子。而将1 μg长同源臂打靶片段电转化E. coli BL21/pKD46感受态细胞，抗性平板上生长出130个转化子，进一步PCR鉴定结果显示，有55%的转化子属于alr敲除突变体，其余45%为假阳性，属于脱靶抗性转化子。以上结果尤其体现出，使用短同源臂及长同源臂打靶片段，λ-Red介导的同源重组脱靶率差异巨大。对于CRISPR/Cas9技术敲除，将1 μg的同源修复供体DNA片段电转化E. coli BL21/pCas感受态，平板上长出的转化子数量约为325个，进一步使用alr-JC-F/alr-JC-R为引物对转化子作PCR鉴定，结果显示95%的转化子属于alr敲除突变体。

(a) (b)注：(a) CRISPR/Cas9基因敲除技术流程图；(b) 敲除突变株E. coli BL21 Δalr-CRISPR的PCR鉴定。M：DNA marker；1：product of BL21Δalr-CRISPR，422 bp。

Figure 3. Construction of E. coli BL21 Δalr-CRISPR

图3. 敲除突变株E. coli BL21 Δalr-CRISPR的构建

4. 结论与讨论

λ-Red和CRISPR/Cas9技术进行E. coli BL21 alr基因敲除实验结果表明：在E. coli中，使用短同源臂靶打靶片段的Red敲除技术，转化子脱靶率超高，这使阳性转化子鉴定工作量大增；使用长同源臂打靶片段的Red敲除技术，较为容易检测到阳性转化子；使用CRISPR/Cas9技术，敲除效率显著优于λ-Red技术。基于长同源臂打靶片段的Red敲除技术和CRISPR/Cas9技术都能够对E. coli染色体进行高效的基因敲除。

在λ-Red两步同源重组敲除系统中，本实验进行了短、长两种不同同源臂打靶片段的基因敲除。短同源臂打靶片段基因敲除，以pKD13质粒为模板，使用分别携带40~60 nt上下游同源臂的引物进行PCR扩增，可直接获得包含卡那抗性盒FLT-kan^R-FLT的短同源臂打靶片段 [12]，这省去了酶切、连接或重叠PCR等步骤，在一定程度上缩短了实验进程 [15]，但本研究表明了其具有超高的脱靶率。长同源臂打靶片段基因敲除，需要连续的酶切、连接或重叠PCR才能将上下游片段和卡那抗性盒FLT-kan^R-FLT连接起来。实验结果表明，打靶片段同源臂长度的增加，通过降低脱靶率，提升了打靶效率。在Red基因敲除技术中，需要pCP20质粒编码的FLP重组酶来介导第二次位点特异性重组进行卡那霉素抗性标记的彻底删除，第二次重组后FRT位点遗留在染色体上。因此，Red基因敲除技术属于无标记敲除(markerless knockout)，没有做到真正的无痕敲除(scarless knockout)。另外，Red系统不能做到连续敲除，在敲除后续基因时仍然需要将pKD46质粒转入细胞中，这成为其又一缺陷 [16]。

基于pCas和pTargetF双质粒系统，CRISPR/Cas9基因编辑技术可以对大肠杆菌基因组DNA进行高效的基因敲除。本研究结果显示了CRISPR/Cas9技术敲除效率显著优于λ-Red技术。由于sgRNA的介导，Cas9蛋白能精确结合到待编辑基因片段，其可经一次重组就可以达到理性化的编辑效果，可以做到无痕敲除或者定向敲入，不会在基因组DNA上留下特殊位点。由于pCas质粒的稳定性，在构建双基因敲除实验中，若有下一轮敲除需求，率先获得的基因突变株就可以先不消除pCas质粒而直接用于另一基因的敲除。另外，该系统可进行多基因的同时编辑，只需将识别靶向基因的20 bp寡核苷酸连入到pTargetF质粒中，再将这一新的pTargetF-sgRNA和相应的同源修复供体DNA共转到含有pCas质粒的菌株当中，就可以实现多个基因的同时打靶操作 [13]。

综上所述，长同源臂打靶片段Red敲除技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术，都可用于E. coli染色体基因的高效敲除。CRISPR/Cas9介导的基因敲除更具有优势，其只需要一次同源重组修复便可实现无痕且可连续的基因敲除。另外，由于Cas9蛋白对靶点20 bp序列的识别选择，CRISPR/Cas9技术亦可能会在某些基因序列中产生大范围程度脱靶现象 [17]。

基金项目

河北省自然科学基金(C2020204085)。

NOTES

^*通讯作者。