1. 引言
杜鹃(Rhododendron spp.)是我国的十大传统名花之一，也是世界著名的木本观赏植物 [1]。滇南杜鹃(Rhododendron hancockii Hemsl.)隶属杜鹃花科(Erieaceae)杜鹃花属(Rhododendron)马银花亚属(Subgen. Azaleastrum Planch)，常绿灌木或乔木 [2]，其花冠白色而具有芳香，枝繁叶茂，新叶红色，具有很强的观赏性 [3]。
杜鹃花通常采取扦插繁殖的繁殖方式，但是常绿杜鹃类由于其生根困难，繁殖系数低，同时也受繁殖季节和母株材料的影响，很难进行快速大量繁殖，极大限制了常绿杜鹃的开发与利用 [4]。目前杜鹃组织培养处理的外植体有茎尖、带腋芽的幼茎、幼叶、花蕾、种子等 [5] [6] [7] [8]。通过植物组织培养技术可以实现部分种类杜鹃的快速繁殖，这对于保护与开发其种质资源具有重要意义。
杜鹃花种子量大，播种繁殖系数高，但幼苗生长缓慢，管理困难，通过无菌播种可以有效缩短杜鹃播种育苗的生长周期。用滇南杜鹃的种子进行无菌播种和快繁研究，可为滇南杜鹃的引种驯化和种质资源保护提供科学依据。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
采用野生的滇南杜鹃种子，种子采自云南省玉溪市易门县。
2.2. 方法
2.2.1. 种子的杀菌处理
用纱布将滇南杜鹃种子包好，进行消毒：放入70%的酒精消毒后用无菌水冲洗2~3次，用0.1%升汞浸泡后无菌水冲洗3~4遍，再次用0.1%升汞浸泡无菌水冲洗4~5遍，之后将种子接种于初代培养基WPM + 4 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA。每瓶接种10粒种子，接种45瓶，每处理重复3次。接种后观察并记录不同消毒处理后的萌发率、污染率和死亡率。种子消毒方式详见表1。
Table 1. Different germicidal treatments of seeds
表1. 种子不同的杀菌处理
2.2.2. 继代培养基的筛选
取培养至50~55 d的滇南杜鹃无菌苗，切去顶芽和基部，留1~2 cm长的无菌苗茎段，接种于继代培养基中，每瓶接种3~4棵，接种60瓶，不定芽的诱导培养基以WPM为基本培养基，添加0.01 mg/L NAA和不同浓度的ZT (2.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/L)，每处理重复3次。接种后观察并记录每株分化的芽数和长势。
2.2.3. 生根培养基的筛选
取30~35 d的继代培养的滇南杜鹃丛生苗，并将带顶芽的芽苗单株切下，然后每棵苗切去基部留2~3 cm，接种于生根培养基中，每瓶放4棵，接种60瓶。生根培养基以WPM为基本培养基，添加1 mg/L NAA和不同浓度的IBA (0.5、0.7、1.0 mg/L)，每处理重复3次。接种后观察并记录苗的生根率和平均生根数。
2.2.4. 各指标计算公式
萌发率 = 发芽的种子数/处理种子数 × 100%
死亡率 = 未萌发种子/处理种子数 × 100%
污染率 = 污染种子数/处理种子数 × 100%
生根率 = 生根数/接种苗数 × 100%
2.2.5. 培养条件
试验所用培养基均附加7 g/L琼脂，30 g/L蔗糖，pH值控制在5.6~5.7。将培养基置于25℃条件下，12 h光/12 h暗下培养，光照强度为3000~4500 lx。
3. 结果与分析
3.1. 不同杀菌处理的效果
由表2可以得出，随着消毒时间增加，滇南杜鹃污染率下降，但同时死亡率增加萌发率降低，说明在种子灭菌处理过程中，升汞长时间的浸泡容易让种子受到毒害而死亡。而短时间的消毒，如处理1又难以把种子携带的细菌消毒干净，容易产生污染。
灭菌处理后的种子接种于初代培养基中，培养40 d时，处理2和处理3的滇南杜鹃最先长出了苗，经过50 d的培养，发现处理2和处理3的滇南杜鹃总体长势很好，苗的生长速度较快，叶色浓绿、苗健壮。处理4和处理5很多苗都不生长，叶片发黄，苗矮小。综合各灭菌处理的效果，得出处理2即70%酒精浸泡30 s + 0.1%升汞浸泡3 min (两次)这个处理是最有效的消毒方法，污染率为16.67%，死亡率为23.33%，萌发率为76.67%。
Table 2. Effects of different sterilization combinations on seeds
表2. 不同灭菌组合处理对种子的影响
3.2. 不同激素配比对无菌苗继代增殖的影响
从表3可以看出，继代培养的苗，在不添加激素的WPM培养基中无生长量，且未发生增殖。在处理2条件下无菌苗生长情况最明显，9 d后开始有绿色的小点突起，14 d后，切口开始有芽点冒出，30 d后之前苗上的芽点已经长成独立侧枝，40 d后苗大多数已长成丛生苗，而且处理2普遍芽大，枝条粗壮，枝条多，叶色深绿，并且分化很快也很多，长势很好。与处理2相比，其它处理下无菌苗的长势都不好：处理3和处理4叶色变淡长势变慢。处理5和处理6玻璃化问题很严重，具体表现为苗的叶和嫩枝呈水晶透明或半透明水渍状，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎。
随着ZT的浓度增加，苗的增殖效果减弱，同时出现玻璃化现象。高浓度的ZT下的杜鹃枝条少且细小，叶色发黄，组培苗较小，苗的分化变慢，苗的总体生长趋势在下降，而低浓度的成活率高，枝条多且粗壮，叶色深绿，最好的继代培养基是处理2，即WPM + 2 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA。
Table 3. Effects of different hormone combinations on Subculture and proliferation of aseptic seedlings
表3. 不同激素配比对无菌苗继代增殖的影响
3.3. 不同激素配比对继代培养苗生根的影响
继代培养得到的苗放进生根培养基中培养7 d后，发现大多苗基部开始有少量的愈伤组织出现，苗的愈伤组织和基部有白色须根最先出现在IBA浓度为0.7 mg/L和1 mg/L的生根培养基中，30 d后开始统计生根率。由表4可看出，在不添加任何激素的WPM培养基中，无菌苗不能生根。在相同浓度的NAA条件下，滇南杜鹃的组培苗生根率随着IBA浓度增加而上升，当IBA浓度最高为1 mg/L时，生根率也达到最高，为57%，平均生根数为3.21。得出滇南杜鹃最佳生根培养基是：WPM + 1 mg/L NAA + IBA。
Table 4. Effects of different hormone ratios on Rooting of aseptic seedlings
表4. 不同激素配比对无菌苗生根的影响
4. 讨论
有效的控制污染是滇南杜鹃无菌播种是否成功的关键技术之一。本试验中采用了0.1%的升汞溶液为主要的消毒灭菌剂，控制其处理的次数为短时间的2次，可以一定程度上避免种子在升汞中长时间的浸泡，减少升汞对种子的毒害。本试验中：70%酒精浸泡30 s + 0.1%升汞浸泡3 min (2次)是最适宜的灭菌处理，这与吴雅文 [9] 等人对迷人杜鹃种子的灭菌试验中的结果相同。
适宜的ZT能提高苗的增殖率，组培苗芽和枝条都生长粗壮，叶片颜色为深绿，但是过高的ZT浓度下的滇南杜鹃苗较小，继代成活率低，玻璃化严重，具体表现为苗的叶和嫩枝呈水晶透明或半透明水渍状，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎，分化能力降低，所以很难成活，严重影响了组培苗繁殖率。本实验设置了ZT的几个浓度梯度对比滇南杜鹃的增殖效果，发现与云锦杜鹃组培的结果一致 [10]，即低浓度的ZT有利于杜鹃生长。另外通过试验后减少ZT浓度，发现玻璃化问题得到缓解，确定玻璃化问题主要来源于细胞分裂素的浓度过高。而且ZT费用相对较高，综合考虑可以适当减少ZT用量。
本试验发现在NAA浓度(1 mg/L)不变，而IBA浓度在0~1 mg/L的范围内时，滇南杜鹃生根率随IBA的浓度增加而增多。但是最高的生根率仅为57%，未达到较为理想的生根效果。因此后续实验中，应加大IBA浓度，以便筛选更好的滇南杜鹃生根培养基。
5. 结论
在滇南杜鹃的组织培养过程中，消毒的药剂的选择、消毒时间的把握、消毒操作都至关重要。滇南杜鹃的最适消毒方法是：酒精浸泡30 s + 0.1%升汞浸泡3 min (2次)，滇南杜鹃种子在WPM + 4 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA培养基上的萌发率为76.67%。植物生长调节剂在植物组织培养过程中起到了非常重要的作用，在一定的激素比例下有助于愈伤组织的诱导，不定芽和不定根的形成。诱导不定芽的最佳培养基是WPM + 2 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA，每株分化的芽数是2.92。最佳生根培养基是WPM + 1 mg/L NAA + 1 mg/L IBA，生根率为57%，平均生根数为3.21。
基金项目
本项目得到云南省现代农业花卉苗木产业技术体系建设项目(2017KJTX0010)资助。
NOTES
*通讯作者。