摘要: 海马是世界上极其短缺的珍贵药源性海洋硬骨鱼类，具有独特的雄性育儿机制和性腺结构。解析海马性腺的组织学结构对提高海马人工养殖的效率具有重要意义。冰冻组织切片相比石蜡切片具有快捷、操作简便等优点，然高质量冰冻切片的制片易受多重因素影响，其中固定液是影响后续HE染色的关键因素之一。本实验比较了8种常用固定液对海马卵巢冰冻切片HE染色的影响。结果显示，冰醋酸固定的卵巢组织结构清晰、细胞核边界分明，核质比高，且卵黄颗粒亦着色明显，是一种较为理想的海马卵巢冰冻切片固定液。
Abstract:
Seahorse is a kind of precious marine medicinal teleosts with special father’s rearing pattern and gonadal structure. Analyzing the histological structure of seahorse gonads is significant of improvement in efficiency of artificial breeding. Compared with paraffin section, frozen section has a fast and simple operation, while the quality of which is susceptible to multiple factors. The fixative is a key factor for Hematoxylin-Eosin (HE) staining. In our study, we chose 8 kinds of fixatives for the frozen section of seahorse ovary and compared the quality of HE stain, results showed that glacial acetic acid fixation was an ideal fixative for frozen sections of seahorse ovary stained with HE, which displayed a clear tissue structure with distinct nuclear boundary, high nucleo-plasmic contrast and bright-coloured yolk granules.
1. 引言
海马隶属海龙科，是世界上极其短缺的珍贵药源性海洋硬骨鱼类，素有“南方人参”的美誉 [1]。全球每年的海马交易量高达2000多万只，市场供不应求带来的过度捕捞以及环境的日趋恶化使海马自然资源已近枯竭，自2004年起我国已把海马纳入二级重大保护动物体系，至2019年世界自然保护联盟IUCN已将44种海马录入了《濒危物种红色名录》 [2]，因此人工养殖已成为实现海马资源可持续利用的重要途径。
相异于大多数硬骨鱼类，海马在繁殖过程中采取雄性卵胎生策略，雌海马将成熟的卵母细胞注入雄海马育儿袋中，卵母细胞在育儿袋中受精并完成胚胎发育过程 [3]。雌海马的卵巢呈双生殖脊规则排列，而雄海马精巢含有独特的中央生精腔 [4]，其独特的繁育方式和性腺结构使海马的人工养殖技术遇到了瓶颈。现阶段我国的海马养殖普遍面临着种质退化、繁殖效率低、幼体成活率低等问题，海马性腺的组织学结构的研究是解析海马的繁育机制的前提。
组织学中最常用的方法为切片标本制备。冰冻切片是一种在低温条件下将生物组织快速冻结并达到一定硬度后进行恒温冷冻切片的实验技术 [5]。相较于石蜡切片制片环节复杂繁多、实验周期较长等缺点，冰冻切片不需要经过浸蜡、脱蜡等中间环节，制片快捷，操作步骤简单，组织内的DNA、RNA、蛋白质、脂类等的完整性和生物活性保留程度较好，避免了在石蜡繁琐制片过程中组织分子水平物质的断裂及降解风险，因此冰冻切片的制片广泛应用于免疫组化、免疫荧光、酶检测、组织定位和原位杂交等后续实验中 [6]。然而冰冻切片的制备难度大、要求高，制片质量受多重因素影响，其中切片固定是影响HE染色质量的关键因素之一。本文通过比较8种常用固定液短时固定海马卵巢冰冻切片HE染色的质量，探讨不同固定液对海马卵巢冰冻切片制片效果的影响，为海马卵巢发育的研究奠定了基础。
2. 材料和方法
2.1. 材料
6个月大的雌性线纹海马购买于厦门小澄水产科技有限公司，水温23℃、盐度24‰，暂养两周后取新鲜卵巢组织。
2.2. 方法
2.2.1. 冰冻切片的制备
使用MS-222麻醉剂麻醉性成熟雌性线纹海马后取其卵巢组织，将卵巢组织置于载有OCT的锡箔纸包埋盒中平衡2~5 min，将包埋盒置于液氮中速冻，盒口高于液氮面，至整个OCT包埋剂凝固后放入−80℃冰箱储存待用。
冰冻切片机(Thermo HM525)工作温度调至−22℃，将OCT包埋组织块置于冰冻切片机内20~30 min平衡温度后进行连续切片、贴片，切片厚度为10 um。切片37℃烘干30 min，−80℃储存待用。
2.2.2. 冰冻切片的固定
将−80℃贮存的切片取出后于室温放置5 min。选取8种常用的固定液：① 95%乙醇；② 乙醚酒精(乙醚:乙醇 = 1:1)；③ 10%甲醛；④ 冰醋酸；⑤ AF液(95%乙醇:40%甲醛 = 9:1)；⑥ Davidson’s液(10%甲醛:95%乙醇:冰醋酸:水 = 2:3:1:3)；⑦ 4%多聚甲醛；⑧ 丙酮，用滴片覆盖的方式分别固定切片1 min。
2.2.3. HE染色
固定后的切片于摇床上用蒸馏水摇洗2 min。苏木精染色液染色5 min，自来水漂洗1 min；分化液分化20s，自来水漂洗1 min；返蓝液浸泡5s，自来水漂洗2 min；经70%、95%乙醇梯度脱水各2 min后置于伊红中染色1 min。
2.2.4. 切片透明及封片
将HE染色后的切片依次经70%乙醇脱水30s、80%乙醇脱水1 min、95%乙醇脱水5 min，二甲苯透明5 min后更换新鲜二甲苯再透明5 min，用中性树脂封片。
3. 结果与分析
Table 1. The comparison of HE staining qualities in frozen sections of seahorse ovary with 8 fixatives
表1. 8种固定液对海马卵巢冰冻切片HE染色效果的比较
在显微镜下比较8种不同固定液处理的冰冻切片的HE染色效果，结果如表1所示，八种固定液均能达到快速固定的要求，但染色效果各有差异。在细胞形态方面，除了丙酮引起细胞明显收缩外，其它7种固定液对细胞形态改变不大，仅有轻微的收缩或肿胀。细胞质的着色效果在8种固定液中均呈现鲜艳的粉红色。经冰醋酸固定的细胞核结构清晰、颜色鲜艳，细胞核与细胞质颜色分明，95%乙醇和Davidson’s液固定的细胞核边缘着色模糊、核质对比度较差，乙醚酒精、10%甲醛、AF液、4%多聚甲醛和丙酮固定的切片细胞核染色呈暗灰色，边缘界限模糊，结构不清。在卵黄颗粒着色方面，冰醋酸、乙醚酒精和丙酮的固定效果最佳，成熟卵母细胞的整个卵黄颗粒着色均匀、色彩艳丽，95%乙醇、10%甲醛、AF液和4%多聚甲醛固定的卵黄颗粒着色不均或着色效果差，Davidson’s液固定的卵黄颗粒着色过于饱和而呈黑红色且脱落明显。综合卵巢内各时期的卵母细胞、滤泡细胞以及鞘细胞的HE染色效果(图1)，经冰醋酸固定的冰冻切片结构清晰、HE染色效果最佳。
Figure 1. The HE staining in frozen sections of seahorse ovary with 8 fixatives
图1. 8种固定液固定的海马卵巢冰冻切片HE染色效果
4. 讨论
冰冻切片具有制备快捷、流程简单等优点，但其制作要求高、难度大，易受多重因素影响，新鲜组织速冻切片后应及时固定以抑制或破坏组织细胞内的各种活性酶，防止组织自溶和腐败，从而维持组织细胞与正常的生活时的结构相似 [7]。理想的固定液具有渗透性强、对细胞形态影响小、能较好并均匀地固定球蛋白、白蛋白、核蛋白、核酸、糖、脂类等物质。冰冻切片固定液的选择通常与组织的类型密切相关，不同的组织结构差异较大，孙丽萍等 [8] 对人体卵巢组织的切片HE染色效果进行比较发现AF固定液的固定效果最好；刘天雪 [9] 等发现经Davidson’s固定液固定的大鼠睾丸组织染色后的结构清晰度明显优于其它固定液；梁艳清 [10] 等对大鼠和小鼠的脊髓、神经、肝等器官进行冰冻切片的固定液评估时，发现4%多聚甲醛的综合固定效果最佳；此外，乙醚酒精也在多个物种多个组织中被认定为最适合冰冻切片固定后用于HE染色的固定液 [11] [12]。在我们对海马卵巢冰冻切片HE染色质量进行评估的过程中，我们发现冰醋酸固定的卵巢组织结构清晰，核质着色分明，核质对比度高，卵黄颗粒色彩鲜艳，而其它7种固定液的细胞核及核质对比度均劣于冰醋酸，这可能与卵巢的独特结构相关。
卵巢组织不同于普通的上皮组织、肌肉组织，其内含不种时期的卵母细胞、滤泡细胞、鞘细胞等，其中I时相卵母细胞细胞核致密，II、III时相卵母细胞内开始出现皮质小泡、卵黄颗粒，而IV、V时相卵母细胞中充满了卵黄颗粒 [4]，因此，适用于海马卵巢冰冻切片的固定液在细胞核蛋白及脂类的固定上要求较高。乙醇虽可沉淀各类蛋白，但核蛋白沉淀后可溶于水，不仅使细胞核着色不佳，还会在组织表面形成一层蛋白膜，阻碍固定液和染色液的渗入，从而影响整个染色效果，因此95%乙醇、乙醚酒精(乙醚:乙醇 = 1:1)、AF液(95%乙醇:40%甲醛 = 9:1)、Davidson’s液(10%甲醛:95%乙醇:冰醋酸:水 = 2:3:1:3)对海马卵巢冰冻切片的核染色浅、边界模糊，核质比差；甲醛是通过“桥联”的形式使蛋白形成不溶性的聚合物，并不能沉淀细胞中的蛋白质，且渗透较慢，所以10%甲醛和4%多聚甲醛对I时相卵母细胞细胞核和卵黄颗粒着色欠佳；丙酮可沉淀蛋白、穿渗透力强，故对卵黄颗粒着色明显，但核固定欠佳，且细胞整体呈明显收缩状态；冰醋酸不仅具有穿透力强，可快速沉淀蛋白，还可沉淀染色质，故其细胞核边界清晰，色彩鲜艳，核质比高，且卵黄颗粒亦着色明显，是一种较为理想的海马卵巢冰冻切片固定液。
5. 结论
本实验通过比较海马卵巢冰冻切片经8种固定液固定后的HE染色效果，发现冰醋酸固定液的卵巢组织核质边界清晰、色彩鲜艳、对比度高，且卵黄颗粒亦着色明显，是一种较为理想的海马卵巢冰冻切片固定液。
基金项目
本研究受国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项“水产养殖生物性别和发育的分子基础与调控机制”项目(2018YFD0900200)和天津市科技计划项目技术创新引导专项基金(21YDTPJC00340)共同资助。
NOTES
*通讯作者。