腹膜透析相关性腹膜纤维化有关机制研究进展

Research Progress on the Mechanism of Peritoneal Fibrosis Related to Peritoneal Dialysis

摘要: 腹膜透析患者发生腹膜纤维化会使腹膜的弥散、对流、超滤功能进行性衰退，最终发生超滤衰竭。腹膜纤维化是尿毒症患者长时间腹膜透析治疗后被迫中止腹膜透析最重要的原因。本文主要对腹膜透析相关性腹膜纤维化中TGF-β介导的信号通路、miRNA和lncRNA在腹膜纤维化调控机制中的研究进展作一综述。

Abstract: Peritoneal fibrosis in peritoneal dialysis patients will progressively decline the diffusion, convection, and ultrafiltration functions of the peritoneum, and eventually lead to ultrafiltration failure. And it is the most important reason for forced discontinuation of peritoneal dialysis in uremic patients after prolonged peritoneal dialysis treatment. This article mainly reviews the research progress of TGF-β-mediated signaling pathway, miRNA and lncRNA in the regulation mechanism of peritoneal fibrosis related to the peritoneal dialysis.

1. 前言

腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)是慢性肾功能衰竭发展到尿毒症阶段绝大部分患者选择的肾脏替代治疗模式。与血液透析(hemodialysis, HD)相比，PD具有一些独特的优势，例如PD对血流动力学的影响较小，对残存肾功能保护效果优于HD，感染传染性疾病的风险小 [1]，清除中分子毒素的效果较好，较少发生透析失衡综合征；占用公共卫生资源少、可以居家操作、操作简单方便，社会回归率更高等。并且相较于血液透析，选择PD治疗的终末期肾脏病患者的长期生存率相似但是生活质量却大为提高 [2]。随着PD治疗时间的逐渐延长，腹膜受PD液的非生理性因素持续性刺激，频繁发生的腹膜炎症反应以及氧化应激等引起腹膜间皮细胞缺失，发生上皮–间质转分化(epithelial mesenchymal trans differentiation, EMT)导致腹膜纤维化 [3]，进而引起腹膜弥散、对流、超滤功能渐进性衰退，最终导致负超滤(超滤衰竭)，使患者被迫中止PD治疗。

虽然PD使终末期肾脏病患者的生活质量得到了极大的改善，但是腹膜纤维化导致的超滤衰竭是患者长期进行PD治疗的主要缺点，是患者被迫中止PD治疗的主要原因。在过去的几十年里，研究人员对引起腹膜纤维化发生的原因进行了大量的研究，试图揭示腹膜纤维化背后极为复杂的机制。然而，目前导致PD相关性腹膜纤维化的病因及其相关的发病机制尚未完全阐明，因此本文主要针对PD相关性腹膜纤维化的有关机制及研究进展作一综述，希望能使我们对PD相关性腹膜纤维化的理解更加深刻，对及时干预超滤衰竭的发生、提高PD效率提供理论支持。

2. PD对腹膜形态和功能的影响

腹膜是人体最大的浆膜，构成腹腔的衬里。它由间皮层、基底膜和间皮下间质层构成 [4]。位于最内面的间皮层由间皮细胞构成，来源于中胚层，同时具有上皮和间充质2种特征，因此具有较强的可塑性，这是腹膜间皮细胞在特定条件下能够发生EMT的基础。间皮细胞形状似鹅卵石样，直径约25 μm，其表面覆盖数目众多的微绒毛和少量纤毛，有板层小体镶嵌其中。它是一种代谢高度活跃的细胞，具有发达的细胞内囊泡系统和细胞表面糖萼 [5]，调节腹膜炎症和腹膜组织的重塑。基底膜起支撑腹膜间皮细胞的作用，由一层厚度小于100 nm的IV型胶原和层粘连蛋白等细胞外基质组成，腹膜间皮细胞可以分泌β1整合素作用于层粘连蛋白促进粘附 [6]。腹膜间皮细胞与基底膜之间的结合很弱，轻微的损伤会导致细胞脱落，暴露出基底膜和下面的间质。这也是腹膜间皮细胞发生EMT的基础。最外面一层是间皮下层，主要由I型胶原、淋巴管和血管、纤维连接蛋白、免疫细胞(巨噬细胞等)以及极少量成纤维细胞构成 [7]。

随着PD治疗的不断进行，腹膜的结构和功能随之发生显著变化：腹膜间皮细胞细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增加使间皮下致密区不断增厚和发生血管病变，这种血管病变表现为腹膜组织中有新生血管生成，血管壁硬化、血管腔变薄，血管基底膜增厚、发生透明样变。这些病变都与腹膜功能衰竭有关 [8]。与此同时，腹膜间皮细胞也发生渐进性变化：间皮细胞表面被覆的微绒毛减少、萎缩以致消失，间皮细胞肥大、细胞内空泡增多，随后间皮细胞的细胞间接触—紧密连接松解，原有的细胞极性—顶端-基底侧极性消失，粘附分子下调，最后间皮细胞能够降解基底膜并从基底膜上脱落，向间质侵入 [9]。在这些过程中，间皮细胞失去了上皮细胞表型，即细胞间接触、细胞基质相互作用和细胞极性 [10]，失去E-钙粘蛋白(E-cadherin)、连接粘附分子1 (JAM1)等上皮标志物，获得成纤维细胞的形态，向间皮下迁移的能力，表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白(FSP-1)等 [11] 间充质标志物，分泌胶原纤维增多使ECM增厚，发生EMT，逐渐进展至腹膜纤维化 [12]。如果不采取措施进行干预，极少数患者会发展成包裹性腹膜硬化症(encapsulated peritoneal sclerosis, EPS)，这是一种程度更加严重的致命的腹膜纤维化形式，即使在此时中止PD治疗，也不能阻止腹膜纤维化进程，甚至会演变成腹腔脏器分隔、包裹，发生肠梗阻，病情极其凶险 [13]。

3. TGF-β信号通路与PD相关性腹膜纤维化

“在EMT和腹膜纤维化的过程中，关键的纤维化因子通过细胞膜上的受体和下游特定的细胞内信号级联，触发作用于细胞基质基因启动子区域的转录因子激活其转录。” [14] 根据目前研究，有许多纤维化因子介导的细胞内级联信号转导通路被发现与腹膜纤维化有关 [15]，其中TGF-β在EMT发生中有至关重要的作用 [16]。TGF-β是具有广泛生物调节作用的生长因子超家族的一员 [17]，来自于哺乳动物平滑肌细胞、上皮细胞、成纤维细胞等，控制一系列不同的细胞反应，包括细胞增殖、凋亡、自噬、分化、ECM重塑、器官纤维化和胚胎发育等 [18] [19]，是PD相关性腹膜纤维化的关键因子。TGF-β可以通过激活经典的(Smads依赖)和非经典的(非Smads依赖)信号通路诱导腹膜纤维化。

3.1. TGF-β/Smads依赖通路

TGF-β与TGF-β受体2 (TGFR2)结合，继而招募TGFR1形成异源三聚体，在此过程中TGFR1被磷酸化激活，随后活性TGFR1磷酸化Smad2和Smad3，它们与Smad4络合并移位到细胞核中，与各种辅助激活因子和辅助抑制因子协同调节靶基因的转录 [20]，该复合物的Smad3组分直接与基因启动子结合，诱导促纤维化分子的转录，此外，Smad3还可以诱导促纤维化的miRNA和lncRNA的转录，同时间接抑制抗纤维化miRNA的转录 [19]。

Duan等人 [21] 发现，小鼠的Smad3基因被敲除后，TGF-β诱导的EMT被明显抑制，其腹膜间皮细胞只有少量的ECM沉积，同时没有发现Smad2、Smad3表达。相反，Smad2基因被敲除后，小鼠腹膜间皮细胞高表达TGF-β，出现大量的ECM沉积，腹膜厚度相较于对照组显著增加，腹膜纤维化程度显著加重，这提示TGF-β与Smad2、Smad3同腹膜纤维化的发生有密切关系，并且Smad2和Smad3在腹膜纤维化中的作用相反。有研究者在其它动物实验中也得到了类似的结论，他们连续30天向野生型小鼠腹腔内注射高糖PD液，发现会显著增加小鼠腹膜纤维化程度，而Smad3敲除小鼠可以抵抗这种腹膜纤维化 [22]。张露等人 [23] 在人腹膜间皮细胞中发现，通过剂量依赖性的方式，黄芪甲苷使磷酸化的Smad2/3 (p-Smad2/3)显著减少，同时观察到在蛋白和核酸水平Smad7表达增多，但是这种表达增多和TGFR1、TGFR2没有关系，进一步通过慢病毒转染证实，Smad7可以负调节Smad2/3磷酸化激活，发挥拮抗EMT的作用。另外有研究表明 [24]，在长期进行PD的腹膜纤维化大鼠模型中，经过Tamoxifen和重组BMP-7治疗，也可以通过抑制Smad3活化，增加Smad7的表达水平，使大鼠模型的超滤量增加，腹膜血管生成减少，促进腹膜滤过功能恢复。张莹等 [25] 通过体内和体外实验研究发现，小白菊内酯可以使TGF-β诱导的人腹膜间皮细胞中代表上皮的指标E-cadherin表达水平增加，纤维化指标Collagen的表达水平降低，即小白菊内酯抑制了TGF-β诱导EMT，进一步研究发现小白菊内酯既能够干扰Smad2/3转移至细胞核，也能抑制Smad2/3的转录活性，而且TGF-β/非Smads依赖通路中的ERK、p38、AKT的磷酸化并没有被抑制。上述有多种研究都是通过使用药物阻断或抑制信号传导通路的某一个蛋白或核酸得出结论的，一方面提示Smads依赖通路的重要作用，另一方面帮助我们得到寻找临床治疗的作用靶点的新启示。

3.2. TGF-β/非Smads依赖通路

与TGF-β/Smads依赖通路相比较，TGF-β/非Smads依赖通路则具有更加多样化的特点。其中，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是TGF-β/非Smads依赖通路的重要组成部分，主要包含p38/MAPK、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等，其它较为熟知的通路还包括磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B (PI3K-AKT)通路，JAK/STAT通路、PKC通路等。

研究证实，激活ERK信号的TGF-β受体复合体不同于激活Smads的受体复合体 [26] [27]。TGF-β1可以在没有配体刺激的情况下，通过磷酸化SHCA的SH2和PTB结构域，使聚集在TGFR1上的SHCA磷酸化，促进SHCA-Grb2-SOS复合物的形成，导致MEK1和/或MEK2以及ERK的激活引起EMT [28]，后来另外有研究发现 [29] [30]，阻断ERK信号通路后，发生EMT的间皮细胞的间充质表型反而向上皮细胞表型过渡，腹膜纤维化减轻，腹膜功能得到部分恢复。研究者们发现 [30] [31]，在大鼠腹膜间皮细胞中基因敲除JNK或者应用药物抑制JNK活性后，可以抑制TGF-β诱导的Smad3磷酸化激活和核转位，减少腹膜间皮细胞的信号传递，显著抑制EMT的发生。除了能够控制细胞的分化和凋亡，p38/MAPK、JNK/MAPK信号通路也被证实参与TGF-β诱导的EMT，它们是被TGF-β通过激活TAK1 (TGF-β活化激酶1)的。与细胞在静止状态时的激活水平不同，p38在腹膜间皮细胞融合的条件下激活水平增加，激活后的p38能够使腹膜间皮细胞的上皮特征蛋白E-cadherin保持在稳定水平，通过下调TAK-1/NF-κB、ERK1/2活性的反馈机制来限制EMT的强度 [32]。还有研究者发现 [33]，被橄榄油多酚提取物处理的间皮细胞显示出抵抗TGF-β诱导EMT的作用，这种抵抗作用是由于ERK、JNK和p38/MAPK这3种信号转导通路同时被抑制，使Smad2/3依赖和非Smad依赖通路也同时被阻断导致的。PI3K可以磷酸化激活AKT，活化后的AKT激活mTOR复合物参与EMT [34]，一项在腹膜水平的研究发现 [35]，Smad3基因缺陷型小鼠和野生型小鼠在转染TGF-β1质粒后，两者的PIK3蛋白和AKT蛋白表达均增多，同时Smad3基因缺陷型小鼠间皮细胞发生向间质转变的过渡反应，应用雷帕霉素治疗后，可以抑制mTOR的上游通路，抑制α-SMA表达，稳定E-catenin，消除其发生的过渡反应，提示PI3K-AKT参与EMT。樊敏等 [36] 将PI3K特异性抑制剂加入经TGF-β1刺激的人腹膜间皮细胞中，同样观察到α-SMA的表达显著被抑制，E-cadherin蛋白表达增加，阻断P13K/Akt通路能够减弱TGF-β诱导的EMT。以上研究表明TGF-β/非Smads依赖通路在EMT过程中也有推波助澜的作用，而且TGF-β介导的两条通路有时存在共同作用的串扰现象，通过TGF-β受体激活Smads依赖通路或任何其他非Smad通路，都可以补充Smad信号，促进TGF-β的生理性反应。

非Smad依赖性TGF-β信号通路的展示和受体相关蛋白对TGF-β信号的调控表明，我们对Smad信号的理解已经超越了Smad信号作为TGF-β信号效应器的线性模型。将基因组和蛋白质组的方法结合起来，结合RNA干扰技术和小鼠基因操作，将有助于我们理解细胞对TGF-β反应的可塑性，以及TGF-β信号成分在协调信号事件和维持细胞和组织稳态中的作用。

4. ncRNA参与调控PD相关性腹膜纤维化

随着对腹膜纤维化机制研究的不断深入，研究者们对表观遗传修饰在组织、器官纤维化疾病调控中的重要作用的认识也越来越深刻，DNA甲基化、非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA)和组蛋白修饰 [37] 是表观遗传的三种形式。自从miRNA的发现揭开了细胞功能调节的新层面，ncRNA逐渐成为PD相关性腹膜纤维化发生机制中的研究热点。ncRNA是不转录成肽的RNA，从狭义上讲，ncRNA主要是指微小RNA (microRNA, miRNA)和长链非编码RNA (long chain noncoding RNA, lncRNA) [41]。

4.1. miRNA

miRNA是一种单链短(21~25个核苷酸) RNA，不转录成肽，是ncRNA中最著名的亚类。依据其对PD相关性腹膜纤维化的促进或抑制作用，可以被分为促进纤维化miRNA和抑制纤维化miRNA。

4.1.1. 促进纤维化的miRNA

miRNA-21是一个具有代表性的促纤维化miRNA，已有研究证明应用该miRNA抑制剂可以靶向促进其靶基因Sprouty-1 [39]、PTEN [40] 转录，促进EMT及纤维化进程，而应用模拟物则表现出相反的结果。更为重要的是，miRNA-21还可以同时调节Smads依赖 [41] 和非Smads依赖 [39] 两条信号转导通路参与腹膜纤维化。腹腔注射miRNA-21-5p抑制剂部分通过增加具有抗炎作用的细胞因子过氧化物酶体增殖物激活受体-α的水平来改善小鼠模型的腹膜纤维化 [38]。BMP也是TGF-β超家族的成员，其中BMP-7具有抗纤维化特性，有研究通过双荧光素酶报告实验证实miRNA-30b可以直接靶向抑制BMP-7，促进纤维化进程 [42]。成纤维细胞生长因子10 (FGF10)作为一种生长因子，可通过Ras-β和PI3K-AKT途径诱导人腹膜间皮细胞的EMT [43]，在小鼠纤维化模型中，转染外源性miR-145质粒可以抑制FGF10而增强EMT，而抑制miR-145表达可促进FGF10的表达并逆转EMT [44]。Zhang等人 [45] 发现PD小鼠应用Apigenin治疗后可以降低腹膜间皮细胞中miR-34a的表达水平，抑制了腹膜纤维化发展，并且观察到多个EMT生物标志物的表达发生了相应的变化。Che等人 [46] 发现在间皮细胞中，参与腹膜纤维化的SRF可以与miR-199a-5p和miR-214-3p的启动子结合导致EMT，过表达miR-199a-5p或miR-214-3p可加重细胞迁移和EMT，但可降低细胞黏附，而沉默这两种miRNA具有相反的作用，应用血清反应因子抑制剂也证实miR-199a-5p和miR-214-3p可减轻腹膜纤维化大鼠模型的腹膜纤维化程度。Liu等人 [47] 发现高糖PD液能诱导大鼠miR-122-5p表达增多，Smad5表达减少，沉默miR-122-5p可以改善PD大鼠的腹膜纤维化和EMT过程，同时可以抑制Wnt/β-catenin 信号通路，进一步证实Smad5是miR-122-5p的靶基因，miR-122-5p通过靶向调节Smad5表达来激活Wnt/β-catenin通路，加重PD相关性腹膜纤维化程度，这种作用可以被Smad5过表达显著逆转。Li等人 [48] 收集PD患者的腹透液发现，在PD时间较长、净超滤较低患者的腹透液中，缺氧诱导因子1-α (HIF1-α)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白水平明显较高，而miR-17-5水平较低，进一步用质粒转染人腹膜间皮细胞发现HIF1-α mRNA和VEGF mRNA的沉默或过表达会导致miR17-5p的增加或减少，反之亦然，证实HIF1-α和VEGF通过参与miR-17-5p的调节机制相互调节，介导腹膜纤维化。

4.1.2. 抑制纤维化的miRNA

He等人 [49] 观察到在尿毒症PD大鼠模型中过表达miR-15a-5p可以改善腹膜纤维化引起的组织病理学改变，同时使VEGF显著减少，通过双荧光素酶报告实验和FISH证明VEGF受miR-15a-5p，使用Axitinib抑制VEGF后也得到纤维化改善的结果，提示miR-15a-5p是PD相关性腹膜纤维化的保护性miRNA。研究发现，在PD患者PD流出液中miR-302c表达水平降低，且与CTGF表达水平呈负相关，在用慢病毒过表达miR-302c后，可以逆转TGFβ-1诱导的CTGF表达上调，明显缓解PD相关腹膜纤维化程度 [50]。miR-200家族被发现在腹膜纤维化的发病机制中起重要作用，这种作用是通过ZEB元件介导的，ZEB1/2协同作用可以调控EMT进程 [51]。研究者们发现 [52] [53] 发现在PD模型大鼠的腹膜组织中，miR-200a的表达显著下降，他们在人腹膜间皮细胞中证实，miR-200a可以靶向调节E-cadherin转录抑制因子ZEB1/2，对TGF-β1诱导的胶原表达和EMT具有负性调节作用。随后在PD大鼠模型中转染miR-200a质粒，发现miR-200a显著减少纤维化标志物Col-I和FN蛋白的表达水平和腹膜厚度，进一步证实miR-200a对进展性腹膜纤维化的干预作用和对腹膜功能损伤的保护作用。与miR-200a不同，miR-200c可以直接靶向ZEB2和Notch1，间接靶向Jagged2，减弱EMT转录因子和间质标志物的表达发挥腹膜纤维化保护作用 [54]。这提示miR-200家族成员对PD相关性腹膜纤维化的治疗潜力，也将成为防治PD患者腹膜纤维化的新靶点。Snail是Snail家族的成员，是参与腹膜间皮细胞EMT的转录因子，在所有EMT过程中都表达上调，可以直接抑制E-cadherin的表达诱导EMT。有研究发现 [55]，在PD患者腹膜组织中，miR-30a的表达水平明显下降，Snail表达明显升高，过表达miR-30a可以通过与Snail因子的3’非翻译区结合，降低因TGF-β诱导而升高的Snail的水平，发挥抑制 EMT的保护性作用。

这些研究结果为我们了解miRNA在EMT中的作用以及这些细胞因子、靶向RNA及其下游信号通路之间的复杂关系提供了新的视角，但是将miRNA作为腹膜纤维化的标记物仍然是一个充满挑战的未知数，充满不确定性。miRNA的作用应该在未来的临床研究中更深入的进行研究，使miRNA有希望成为预测和治疗纤维化疾病的新靶点。

4.2. lncRNA

lncRNA是另一种长度超过200个核苷酸的RNA分子，它和miRNA一样，不转录成肽，作为一种潜在调节因子逐渐成为研究热点。与miRNA相比，lncRNA的功能具有复杂性和多样性的特点。

Wang等人 [56] 发现在PD大鼠模型中阻断lncRNA 6030408B16RIK后，WISP2的表达降低，大鼠的腹膜厚度和腹膜间皮纤维数量增加，miR-326-3p抑制剂可使WISP2表达恢复，产生相反的作用，进一步证实miR-326-3p能与WISP2的3’UTR特异结合促进其表达，lncRNA 6030408B16RIK与miR-326-3p特异结合靶向调节WISP2使腹膜纤维化恶化。Wei等人 [57] 在TGF-β诱导间皮细胞 EMT过程中发现，lncRNA AV310809显著高表达，且lncRNA的过表达与Wnt2蛋白的表达呈显著正相关，并伴随着Wnt2/β-catenin信号通路的激活，通过RNA pull-down实验证实lncRNA AV310809直接作用于β-catenin，β-catenin的敲除则部分逆转了lncRNA AV310809的促纤维化作用，提示lncRNA AV310809靶向调控Wnt2/β-catenin信号通路加重纤维化程度。与lncRNA AV310809作用相反，Zhang等人 [58] 通过富集分析、基因交叉关联分析和基因–基因交叉网络以及构建小鼠腹膜纤维化模型研究，确定lncRNA AK089579是miR-296-3p的竞争性内源RNA，它能够促进miR-296-3p的靶基因DOK2的表达，抑制腹膜间皮细胞EMT、迁移和侵袭。最近有研究者发现 [59]，在高糖诱导发生EMT的腹膜间皮细胞中，lncRNA Gas5的表达水平降低，而过表达lncRNA Gas5可以减弱腹膜间皮细胞的EMT，同时发现lncRNA Gas5通过与miR-21结合调节PTEN，进一步研究得出结论lncRNA GAS5与miR-21竞争性结合通过Wnt/β-catenin信号通路调节PTEN的表达，影响腹膜间皮细胞的EMT。

即使关于lncRNA的研究非常有限，但是前人们的研究结果扩大了我们对腹膜纤维化中基因组调控网络的理解，为进一步阐明lncRNA对腹膜纤维化的调控机制提供了一个基础和广阔的视角，也为lncRNA在临床治疗中的成功应用提供了有力的证据。

5. 总结与展望

虽然在过去短短的几年中，PD领域的研究在腹膜纤维化的病理生理学研究、发生机制中的分子生物学研究以及表观遗传学研究较以往取得了长足的进步，但是将已经积累的知识进一步转化为临床治疗和患者利益等方面仍存在相当大的差距。通过更好地认识腹膜纤维化的病理生理学，我们在提高PD质量和患者安全性方面取得了重大进展，比如使用新型的、生物相容性更高的PD液；通过更好地认识腹膜纤维化的分子生物学及表观遗传学，我们希望可以有更加精确、个性化的治疗措施应用于临床，但在此似乎收效甚微。也许这部分是由于所使用的动物模型、特定细胞类型与人类这个生命体的差异。未来的研究仍然应该注重探究腹膜纤维化本身与其背后复杂的机制，在个性化医疗的时代，使基于细胞因子和基因角度的治疗方式也成为一种治疗选择。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。