1. 引言
血鹦鹉，因其体色鲜红，嘴型与鹦鹉嘴型类似而得名，俗称“财神鱼”，寓意财富和健康，受到广大消费者的喜爱，是主要的热带淡水观赏鱼类 [1]。血鹦鹉由两种慈鲷科鱼类杂交而成 [2] ，体型宽厚，体长一般在15 cm左右，最长可达30 cm [3]。作为热带观赏鱼中最大的交易品种，为保持其资源量，满足市场的需求以及探索更加科学和高效的养殖方法，对血鹦鹉生理特征进行更深入的了解和研究就显得尤为重要 [4]。
鱼类的消化过程就是通过分泌消化酶将食物消化分解，再运输到组织器官内，以此来获得用于生长繁殖的能量。对消化酶的研究是鱼类消化生理和营养生理上一项重要的内容，这关乎到鱼类养殖业的发展 [5] [6]。消化酶活性的影响因素较多，其中温度和pH是影响鱼类消化酶活力的两个重要因素。温度对鱼类消化酶活力的影响能够从对北极红点鲑 [7]、翘嘴红鮊 [8]、对斜带髭鲷 [9]、澳洲宝石鱼 [10]、洞庭鲇鱼 [11]、半滑舌鳎 [12]、黑鲷 [13] 等品种研究的研究中发现；pH对鱼类消化酶活力的影响能够在对蓝点马鲛鱼仔鱼 [14]、大黄鱼 [15] 和黄金鲈 [16]、黑鲷、团头鲂 [17]、澳洲宝石鱼、半滑舌鳎等研究中发现。多项试验已证明，温度和pH对鱼类消化酶活力影响显著，而在鱼类不同器官中同一消化酶的活力差异显著。如翘嘴红鲌肝脏和肠道蛋白酶最适温度为50℃，淀粉酶为30℃ [8]。斜带髭鲷肝胰脏和肠道蛋白酶最适温度为40℃，淀粉酶为30℃和40℃ [9]。澳洲宝石鲈肠道蛋白酶、淀粉酶最适温和pH分别为50℃、30℃，7.5、6.2，肝脏蛋白酶、淀粉酶最适温度和pH分别为50℃、30℃，7.5、6.2 [10]。
目前，国内外对于血鹦鹉的研究主要集中在养殖繁育 [18] [19] ，营养饲料 [20] [21] ，体色改良 [22] ，疾病预防等方面，而关于血鹦鹉消化酶活力影响因素的研究较少。本实验通过研究不同温度和pH条件对血鹦鹉肠道和肝胰腺消化酶活力的影响，揭示血鹦鹉消化酶活力的变化特征，为血鹦鹉以及其它热带观赏鱼高效饲料的开发实验依据，为血鹦鹉的健康养殖提供重要的参考资料。
2. 实验材料与方法
2.1. 实验鱼来源
实验所用的血鹦鹉鱼为同一批次取自天津嘉禾田园观赏鱼养殖厂。
2.2. 养殖方法
本实验在天津农学院循环水养殖实验室进行，取初始体长体长14.5 ± 0.5 cm，体重500.0 ± 20.0 g血鹦鹉，于110 cm × 45 cm × 38 cm玻璃水槽中，8尾为一组，共3组，共计24尾。养殖水体温度控制在25℃。溶氧大于5 mg/L，光照采用自然光照。投喂商品饲料，约为体重1%，每天两次(上午8:30；下午17:00)，投喂半小时后吸出残饵。试验周期45天。养殖结束后空腹24 h取样。
2.3. 样品采集及酶液制备
实验前暂停进食24 h，取出血鹦鹉的肠道和肝胰腺组织，去除多余组织并分别称重，预冷重蒸水(0℃~4℃)按质量体积比1:10加入后匀浆，于4℃离心15 min (4000 r/min)，取其上清液作为酶液，在0℃~4℃下保存。
2.4. 温度和pH条件建立
2.4.1. 温度的设定
反应温度的控制用恒温水浴锅来进行。以5℃为一个梯度，在0℃~60℃共设13个梯度来测定蛋白酶和淀粉酶活力；纤维素酶活力测定在0℃~55℃以5℃为一个梯度，设置12个梯度，在此基础上增加设置60℃、70℃、80℃，共计15个梯度。控制pH值为7.0，重复三遍测定。
2.4.2. pH值的设定
在pH 1.0~13.0范围内共设置13个梯度来测定淀粉酶和纤维素酶活力；蛋白酶的测定在此基础上，增加设置pH值为0.5，共14个梯度。在37℃条件下，测定各pH值下的消化酶活力，重复三遍。
2.5. 蛋白酶活力测定
向离心管中加入2 mL 0.5%干酪素溶液，0.1 mL 0.04 M EDTA-2Na，0.8 mL 0.1 M设定pH的缓冲液和0.6 mL酶液，混匀(总体积为3.5 mL)；在设定温度水浴30 min，用1 mL 30%三氯乙酸终止反应；离心15 min (4000 r/min)，取1 mL上清液加入5 mL 0.55 M碳酸钠溶液，1 mL福林试剂，37℃水浴显色15 min；用分光光度计在波长680 nm下测定。
当温度为变量时，缓冲液pH为7.0，按顺序于不同温度(0℃~60℃)下水浴。当pH为变量时，按标号顺序分别加入不同pH (0.5, 1.0~13.0)的缓冲液，在37℃下水浴。
2.6. 淀粉酶活力测定
将离心管标号并加入1 mL 1%淀粉溶液，1 mL 0.1 M设定pH缓冲液，0.5 mL待测酶液摇匀，于设定温度下水浴8 min，再加2 mL DNS指示剂，加盖沸水浴15 min停止反应；快速冷却后加4.5 mL蒸馏水，用分光光度计在波长550 nm比色测定。
当温度为变量，缓冲液pH为7.0，按顺序置于不同温度(0℃~60℃)下水浴。当pH为变量时，按标号顺序分别加入不同pH (1.0~13.0)的缓冲液，在37℃下水浴。
2.7. 纤维素酶活力测定
将0.5%羧甲基纤维素钠溶液、0.1 M设定pH的缓冲液以及待测酶液各1 mL加入离心管中并标号，混匀后在设定温度下进行30 min的水浴糖化；再加入2 mL DNS显色剂，沸水浴15 min显色；冷却后加4 mL蒸馏水，摇匀后在波长550 nm下测定其吸光度。
当温度为变量时，加入pH为7.0的缓冲液，按顺序将15个离心管置于不同温度(0℃~80℃)下水浴。当pH为变量时，按标号顺序将13个离心管分别加入不同pH值(1.0~13.0)的缓冲液，置于37℃下水浴。
2.8. 数据计算与分析
实验数据的分析处理采用Excel 2019及SPSS25.0进行。数据用平均值 ± 标准误(means ± S.E.)表示，用Excel 2019进行数据绘图。使用ANOVA单因素方差分析和Duncan多重比较对实验结果进行显著性检验，以P < 0.05标志差异显著水平。
3. 结果与分析
3.1. 蛋白酶活性
3.1.1. 不同温度对血鹦鹉蛋白酶活力的影响
如表1所示，血鹦鹉肠道和肝胰腺蛋白酶活力随温度升高而升高，超过一定温度后开始下降，呈先升高后下降的趋势。在55℃时，血鹦鹉肠道蛋白酶活力最大，高于其他温度下的蛋白酶活力(P < 0.05)。肝胰腺蛋白酶活力在45℃时最高，在40℃与45℃之间的活力差异显著(P < 0.05)，45℃与50℃的活力差异也显著(P < 0.05)。由此可见，血鹦鹉肠道和肝胰腺蛋白酶的最适温度分别是55℃，45℃。
Table 1. Effects of different temperatures on specific protease activity in intestine and hepatopancreas of blood parrot
表1. 不同温度下血鹦鹉肠道和肝胰腺蛋白酶的活力
注：表中所标字母不同表示差异显著(P < 0.05)，字母相同表示差异不显著(P > 0.05)。
3.1.2. 不同pH值对血鹦鹉蛋白酶活力的影响
由表2可以看出，血鹦鹉肠道和肝胰腺蛋白酶活力随pH值的增加先上升后下降，血鹦鹉肠道蛋白酶活力在pH为8.0时最高，并且在pH为7.0和8.0之间蛋白酶活力差异显著(P < 0.05)，在pH为8.0和9.0之间差异也显著(P < 0.05)。血鹦鹉肝胰腺蛋白酶活力在pH为10.0时最高，活性显著高于其他pH (P < 0.05)。因此，血鹦鹉肠道和肝胰腺蛋白酶的最适pH分别为8.0，10.0。
Table 2. Effects of different pH on specific protease activity in intestine and hepatopancreas of blood parrot
表2. 不同pH下血鹦鹉肠道和肝胰腺蛋白酶的活力
注：表中所标字母不同表示差异显著(P < 0.05)，字母相同表示差异不显著(P > 0.05)。
3.2. 淀粉酶活性
3.2.1. 不同温度对血鹦鹉淀粉酶活力的影响
如表3所示，血鹦鹉肠道淀粉酶的活力随温度的升高先上升后下降；肝胰腺淀粉酶活力随温度升高变化较为平稳，但总体上呈现先上升后下降的趋势。血鹦鹉肠道淀粉酶活力在35℃时最大，显著高于其他温度(P < 0.05)。血鹦鹉肝胰腺淀粉酶活力在25℃时最大，在20℃与25℃之间的活力差异显著(P < 0.05)，25℃与30℃的活力差异也显著(P < 0.05)。因此，血鹦鹉肠道和肝胰腺淀粉酶的最适温度分别为35℃，25℃。
3.2.2. 不同pH值对血鹦鹉淀粉酶活力的影响
如表4所示，血鹦鹉肠道和肝胰腺淀粉酶活力随着pH的增加表现出明显地先上升后下降的趋势。可以看出，血鹦鹉肠道和肝胰腺淀粉酶活力均在pH为7.0时最大，并且在pH为6.0和7.0之间蛋白酶活力差异显著(P < 0.05)，在pH为7.0和8.0之间差异也显著(P < 0.05)。因此，血鹦鹉肠道和肝胰腺淀粉酶的最适pH均为7.0。
Table 3. Effects of different temperatures on specific amylase activity in intestine and hepatopancreas of blood parrot
表3. 不同温度下血鹦鹉肠道和肝胰腺淀粉酶的活力
注：表中所标字母不同表示差异显著(P < 0.05)，字母相同表示差异不显著(P > 0.05)。
Table 4. Effects of different pH onspecific amylase activity in intestine and hepatopancreas of blood parrot
表4. 不同pH下血鹦鹉肠道和肝胰腺淀粉酶的活力
注：表中所标字母不同表示差异显著(P < 0.05)，字母相同表示差异不显著(P > 0.05)。
Table 5. Effects of different temperatures on intestinal cellulase specific activity of blood parrot
表5. 不同温度下血鹦鹉肠道纤维素酶的活力
注：表中所标字母不同表示差异显著(P < 0.05)，字母相同表示差异不显著(P > 0.05)。
Table 6. Effects of different pH values on hepatopancreas cellulase specific activity of blood parrot
表6. 不同pH下血鹦鹉肝胰腺纤维素酶的活力
注：表中所标字母不同表示差异显著(P < 0.05)，字母相同表示差异不显著(P > 0.05)。
3.3. 纤维素酶活性
3.3.1. 不同温度对血鹦鹉纤维素酶活力的影响
如表5所示，随着温度的升高，血鹦鹉肠道纤维素酶活力表现出先升高后下降的趋势，血鹦鹉肠道纤维素酶活力在45℃时最大，在40℃与45℃之间的活力差异显著(P < 0.05)，45℃与50℃的活力差异也显著(P < 0.05)。由此可见，血鹦鹉肠道纤维素酶的最适温度为45℃。
3.3.2. 不同pH值对血鹦鹉纤维素酶活力的影响
由表6可知，随着pH的升高，血鹦鹉肝胰腺纤维素酶活力先升高后下降。血鹦鹉肝胰腺纤维素酶活力在pH为5.0时，血鹦鹉肝胰腺纤维素酶活力最大，并且在pH为4.0和5.0之间差异显著(P < 0.05)，在pH为5.0和6.0之间差异也显著(P < 0.05)。由此可见，血鹦鹉肝胰腺纤维素酶的最适pH为5.0。
4. 讨论
4.1. 温度与血鹦鹉消化酶活力的关系
温度是影响消化酶活力的众多因素之一。血鹦鹉不同消化酶的活性受不同温度的影响不同，其最适温度也不同。实验发现血鹦鹉肠道和肝胰腺中蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶这三种消化酶活力随温度的升高先上升后下降。齐红莉等 [9] 报道，由于温度的升高，斜带髭鲷消化酶活力表现为先升高后下降；韩庆等 [11] 对洞庭鲇鱼的研究以及姜永华对中国龙虾 [23] 的研究中均发现这一现象。在一定范围内，随水温上升提高投饵量，使鱼类生长速度加快，从而降低成本。本实验表明，血鹦鹉肠道蛋白酶的最适温度为55℃，肝胰腺为45℃；淀粉酶分别在35℃、25℃时活性最高；肠道纤维素酶的最适温度为45℃。由这些数据可以看出，血鹦鹉消化酶最适反应温度蛋白酶大于淀粉酶和纤维素酶。陈进树 [24] 在神仙鱼的研究中也发现，淀粉酶的最适温度为40℃，蛋白酶的最适温度为45℃，蛋白酶的最适温度高于淀粉酶的最适温度。沈文英等 [10] 在对澳洲宝石鱼的研究中报道了其蛋白酶最适温度为50℃，淀粉酶为30℃。李代金等 [25] 表明这一现象同样出现在加州鲈鱼中。与试验结果不同，丁贤等 [26] 对异育银鲫消化酶活力的研究发现，其淀粉酶的最适温度高于蛋白酶和纤维素酶的最适温度。异育银鲫和血鹦鹉均属于杂食性淡水鱼类，可能由于两者的生活习性不同，导致消化酶最适环境条件存在差异，具体的原因需要更深一步研究。
4.2. pH与血鹦鹉消化酶活力的关系
随着pH条件的变化，血鹦鹉消化酶活力也受到不同的影响，不同消化酶的最适pH也不同。血鹦鹉肠道和肝胰腺中蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活力在一定范围内随pH的增加而逐渐上升，但当pH升到一定值后，消化酶活力逐渐下降。同类型的报道在蓝点马鲛鱼仔鱼 [14]、黄金鲈 [16]、驼背鲈 [27] 等鱼类中也有出现。本研究表明，血鹦鹉肠道蛋白酶最适pH为8.0，肝胰腺为10.0，淀粉酶为7.0，肝胰腺纤维素酶为5.0。由此可见，血鹦鹉在pH为中性或弱碱性时其蛋白酶和淀粉酶活性最高，而在pH为酸性时纤维素酶活性最高。与实验结果相似，姜永华等 [28] 对中国龙虾的研究发现，其蛋白酶和淀粉酶的最适pH为中性或弱碱性，纤维素酶的最适pH为酸性。梅景良等 [13] 对黑鲷的研究以及刘江华 [27] 等对驼背鲈的研究均有相似的报道。M. Pavasovic等 [29] 在pH为7.0时观察到锯缘青蟹蛋白酶和淀粉酶的最适活性。张弢等 [30] 研究发现公子小丑鱼在pH为6.0时肝脏淀粉酶显示最高活性，其最适pH为酸性；而其余各部位消化酶的最适pH为7.0~8.0。但李俊辉等 [31] 发现，马氏珠母贝在pH为5.0时，其肝胰脏淀粉酶和纤维素酶显示最大活性。导致鱼类各消化酶的最适pH的差异，可能是生活环境或食性的不同造成的。
4.3. 不同消化器官消化酶活力的差异
血鹦鹉不同消化器官中的消化酶活力各不同，并且不同消化器官中消化酶对温度和pH的敏感程度也有所差异。血鹦鹉蛋白酶对温度的敏感程度肠道大于肝胰腺，而肠道淀粉酶对温度的敏感程度小于肝胰腺。在最适温度下，血鹦鹉肠道蛋白酶的活力高于肝胰腺蛋白酶的活力，肠道淀粉酶的活力低于肝胰腺淀粉酶的活力。与本实验结果相似，范镇明等 [32] ，杨婳等 [16] 分别报道，河鲈和黄金鲈在各自最适温度下，其肠道蛋白酶活力高于肝胰脏，而淀粉酶相反。梅景良等 [13] 对黑鲷以及韩庆等 [11] 对洞庭鲇鱼的研究中也有相似的发现。另有研究表明，草鱼胰脏蛋白酶活性微弱，而肠道蛋白酶活力高 [33]。
血鹦鹉肠道蛋白酶对pH的敏感程度小于肝胰腺，而淀粉酶对pH的敏感程度肠道大于肝胰腺。血鹦鹉肠道蛋白酶在最适pH下的活力小于肝胰腺，而肝胰腺淀粉酶的活力小于肠道。这与姜永华等在对中国龙虾的实验结果相符。同样地，刘江华等 [27] 在对驼背鲈的研究中发现，在最适pH下，其肠道淀粉酶的活力大于肝胰腺。但在王琨等 [34] 对鳗鱼研究中得出其蛋白酶和淀粉酶活性大小分别为肠道 > 肝胰脏、肝胰腺 > 肠道，这与本实验的结论并不一致。由此可见，不同消化器官中消化酶活性存在差异，可能由于器官的功能特性不同，但仍需要更深一步的研究。
5. 结论
本文结果显示温度和pH对血鹦鹉肝胰脏、肠道有显著影响。
1) 血鹦鹉肝脏蛋白酶、淀粉酶最适温度为45℃和25℃。肠道蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶最适温度为55℃、35℃和45℃。肝脏蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶最适pH分别为10.0、7.0和5.0，肠道蛋白酶、淀粉酶最适温度分别为8.0和7.0。
2) 在各自最适温度下，血鹦鹉蛋白酶活力大小为肠道 > 肝胰腺，淀粉酶活力大小为肝胰腺 > 肠道；在各自最适pH下，血鹦鹉蛋白酶活力大小为肝胰腺 > 肠道，淀粉酶活力大小为肠道 > 肝胰腺。
基金项目
国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项(2020YFD0900705)及天津市淡水养殖产业技术体系创新团队(ITTFRS2021000-001)。
NOTES
*通讯作者。