1. 引言
子宫内膜异位症(endometriosis, EMT)虽为良性疾病，却存在着如细胞迁移、侵袭、血管生成和广泛组织粘连等恶性肿瘤特征 [1] [2]。EMT症状顽固且易复发，2年平均复发率高达20% [3]，有良性癌之称。胶质瘤相关癌基因同源物1 (Glioma-associated oncogene homolog 1, Gli1)和超音刺猬因子(Sonic hedgehog, Shh)是Shh信号通路中的关键因子，Shh信号通路参与细胞增殖、迁移和侵袭等过程，与肿瘤发生密切相关 [4]，但与EMT的关系研究的较少，本研究通过检测Gli1、Shh在EMT在位和异位子宫内膜的表达，探讨Gli1、Shh在EMT中表达的意义及与术后复发关系。现将结果报告如下：
2. 资料与方法
2.1. 研究对象
选取2018年1月至2019年10月青岛大学附属医院手术的50例卵巢子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜(EMT 1组)和异位子宫内膜(EMT 2组)，参照美国生殖医学协会修订的分类 [5]，其中I~II期20例，III~IV期30例。选取同期50例因其他妇科良性疾病切除子宫或诊断性刮宫患者的正常子宫内膜作对照。EMT组平均年龄(43.26 ± 4.63)岁，中位孕次2 (0~5)次，中位产次1 (0~2)次。对照组平均年龄(44.80 ± 4.20)岁，中位孕次2 (0~4)次，中位产次1 (0~2)次。两组患者年龄、孕次、产次差异无统计学意义(P > 0.05)。纳入标准：所有内膜均为术后病理证实；病史资料完整；术前6个月内未使用激素类药物。排除标准：有严重内外科疾病；术前有放化疗病史。随访统计EMT患者术后2年复发情况。本研究经青岛大学附属医院理论委员会批准。
2.2. 主要试剂
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购自青岛思科捷公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成。兔抗人Gli1、Shh单克隆抗体购自北京博奥森公司(Shh、Gli1工作浓度1:150)，二抗PV-6001购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
2.3. qRT-PCR法检测
使用RNA提取试剂盒提取总RNA，选择A260/A280比值在1.8-2.0的RNA逆转录为cDNA，配制PCR体系扩增，40个循环。引物序列：Gli1正向5'-ATGAAACTGACTGCCGTTGGGATG-3'，反向：5'-TGGATGTGCTCGCTGTTGATGTG-3'；Shh正向：5'-TGTCTGCTGCTAGTCCTCGTCTC-3'，反向：5'-GTGCCTCCTCTTCGAACCC-3'。β-actin正向：5'-GGCTCTTGTGCGTACTGTCCTTC-3'，反向：5'-GCTTCTTGGTGTCGGCTGGTC-3'。以β-actin基因为内参对照。定量分析结果以荧光强度(CT)值表示，用2−ΔΔCT计算Gli1和Shh mRNA的相对表达水平。
2.4. 免疫组化检测
石蜡包埋的组织标本切片，严格按照说明书步骤操作进行免疫组化染色。PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。由病理科医师随机选择5个视野判读结果，镜下表现为黄色或棕色颗粒状沉积视为阳性表达。根据染色强度及阳性细胞占比进行评分 [6]：无阳性细胞计0分，≤10%计1分，11%~50%计2分，51%~75%计3分，>75%计4分。细胞染色与背景无异计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。阳性细胞评分 × 细胞染色强度积分 ≥ 3分为高表达，<3分为低表达。
2.5. 统计学方法
采用SPSS23.0软件统计，正态计量资料以均数 ± 标准差表示，两组比较采用t检验，多组比较采用F检验，组间比较采用LSD-t检验。非正态计量资料以中位数表示，两组比较采用独立样本秩和检验。计数资料以[例(%)]表示，采用卡方检验(包括校正)，相关性分析用Pearson法，复发影响因素采用Logistic回归单因素和多因素分析法，P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. Gli1、Shh在各组内膜组织中mRNA水平的表达
EMT患者在位和异位子宫内膜Gli1、Shh mRNA表达水平均高于对照组(P < 0.05)，EMT在位与异位子宫内膜比较，差异无统计学意义(P > 0.05)，见表1。
3.2. Gli1、Shh在各组内膜组织中蛋白的表达
免疫组化技术检测结果显示：Gli1主要表达于细胞核和细胞浆，Shh主要表达于细胞质。EMT患者在位和异位子宫内膜Gli1、Shh蛋白高表达率明显高于对照组(P < 0.05)，EMT在位与异位子宫内膜比较，差异无统计学意义(P > 0.05)，见表2和图1、图2。
Table 1. Expression of Gli1 and Shh mRNA in endometrium of three groups (
)
表1. 三组内膜Gli1、Shh mRNA的表达(
)
注：与对照组比较，a,bP < 0.05。
Table 2. Comparison of Gli1 and Shh protein expression in endometrium of three groups [n (%)]
表2. 三组内膜Gli1、Shh蛋白表达比较[n (%)]
注：与对照组比较，a,bP < 0.05。
(A) 正常子宫内膜 
(B) EMT在位子宫位内膜 
(C) EMT异位子宫内膜
Figure 1. Expression of Gli1 protein in endometrium of three groups (HE ×200)
图1. 三组内膜Gli1蛋白的表达 (免疫组化 ×200)
(A) 正常子宫内膜 
(B) EMT在位子宫位内膜 
(C) EMT异位子宫内膜
Figure 2. Expression of Shh protein in endometrium of three groups (HE ×200)
图2. 三组内膜Shh蛋白的表达(免疫组化 ×200)
3.3. EMT组织中Gli1与Shh表达的相关性分析
通过Pearson分析表明，EMT组织中Gli1 mRNA与Shh mRNA表达呈正相关(r = 0.621, P < 0.01)，Gli1蛋白与Shh蛋白表达也呈正相关(r = 0.637, P < 0.01)。
3.4. EMT组织中Gli1、Shh蛋白表达与临床分期的关系
EMT组织Gli1、Shh蛋白表达与患者临床分期有关，临床分期III~IV期患者EMT组织中Gli1和Shh蛋白高表达率分别为40.0% (12/30)、33.3% (10/30)，较I~II期患者10.0% (2/20)、5.0% (1/20)高(c2 = 5.357, P < 0.05; c2 = 4.084, P < 0.05)。
3.5. Logistic回归分析EMT患者术后复发危险因素
经过2年随访，9例(18.0%)复发。其中疼痛复发5例(55.6%)，囊肿复发3例(33.3%)，疼痛+囊肿复发1例(11.1%)。以是否术后复发为因变量(0 = 否，1 = 是)，将Gli1和Shh蛋白表达与手术年龄(每5年)、疼痛症状、CA125 (35 U/ml)、临床分期(I~II期、III~IV期)进行单因素Logistic回归分析，结果显示影响术后复发的因素为：手术年龄(P = 0.015)、Shh (P = 0.013)、Gli1 (P = 0.009)。进一步行多因素Logistic回归分析显示：手术年龄轻(P = 0.012)、Gli1高表达(P = 0.019)是EMT患者术后复发危险因素，见表3。
Table 3. Logistic regression analysis of influencing factors of postoperative recurrence in EMT patients
表3. EMT患者术后复发影响因素的Logistic回归分析
4. 讨论
EMT影响全球约10%的育龄妇女，50%~80%的盆腔疼痛妇女和50%的不孕症妇女出现EMT [7]，发病机制复杂，迄今为止，尚无准确诊断EMT的分子生物学标志物，近年，EMT术后复发问题逐渐被重视，严重困扰着EMT患者。因此对EMT的发生发展及术后复发问题的研究极为重要。
Hedgehog (HH)信号通路是经典的胚胎发育信号通路，参与细胞增殖与分化 [8]。Shh作为哺乳动物三种Hh同源基因中表达最典型的一种，在调节细胞增殖、分化和细胞命运等方面起着重要作用 [9]。Shh蛋白合成后与靶细胞的细胞膜表面特异性受体Ptch结合，解除了下游SMO的抑制，促使核转录因子Gli1激活 [10]。Gli1是一种类似krupple的转录因子，属于锌指家族，在机体成熟的组织及细胞中一般很少表达或不表达，激活的Gli1可促进细胞生长与侵袭，增加细胞浸润力、诱导上皮–间充质转化、促血管生成从而促进疾病发生 [11] [12]。
Shh信号通路的激活参与胃癌、肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发生和进展 [13] [14] [15]，在乳腺癌、宫颈癌、宫腔粘连等女性疾病中有重要致病作用 [16] [17] [18]。在EMT中，Shh信号通路的研究仍处于起步阶段。He等仅在EMT在位子宫内膜中发现Shh信号通路的异常激活 [19]；Liu等 [20] 研究发现Gli1在EMT异位子宫内膜中增加，可能通过基质金属蛋白酶2等提高了细胞增殖、迁移和侵袭能力，但与EMT患者临床分期及术后复发的关系尚不清楚。本研究结果显示，EMT在位和异位子宫内膜Gli1、Shh mRNA和蛋白表达均高于正常子宫内膜，且EMT在位和异位子宫内膜之间表达差异无统计学意义，提示Gli1和Shh可能参与了EMT的发生过程，有助于EMT的早期识别，可能与Gli1和Shh促进细胞增殖、迁移、侵袭等过程有关；同时也间接反映了在位内膜在EMT中的作用，证明了“在位内膜决定论” [21]。本研究中Gli1和Shh表达呈正相关，与Shh是上游启动因子，Gli1是下游转录激活因子的关系吻合。此外，本研究通过分析Gli1、Shh蛋白高表达与EMT患者临床分期的关系发现，III~IV期EMT患者Gli1和Shh蛋白高表达率高于I~II期患者，可见Gli1和Shh可能参与了EMT进展，有作为EMT分期依据的可能性。既往研究报道 [22]，手术年龄与EMT术后复发有关，越年轻，越易复发。本研究通过Logistic回归分析发现手术年龄轻、Gli1高表达是EMT术后复发的危险因素，可能与Gli1高表达EMT患者细胞增殖更活跃，细胞浸润力增加有关，Gli1蛋白高表达患者应警惕EMT复发，及早干预。因本次研究样本量相对较少，可增加样本量进一步考察。
5. 结论
综上所述，Gli1、Shh在EMT在位和异位子宫内膜表达上调，且与临床分期有关，Gli1和Shh可能参与了EMT的发生发展，可能具有预测EMT病情严重程度的潜在作用，Gli1高表达EMT患者术后复发风险高，有望成为预测EMT术后复发的生物学标志物。
NOTES
*通讯作者Email: wlmqingyi@163.com