肝移植术后胆汁中胆汁酸水平变化及其对EAD的预测价值

Changes of Bile Acid Level in Bile and Its Predictive Value for EAD after Liver Transplantation

摘要: 目的：观察肝移植术后7天内胆汁中各种胆汁酸的水平变化，探讨其水平变化对肝移植术后早期移植物功能不全(early allograft dysfunction, EAD)发生的预测价值。方法：本文回顾性地选取2020年7月至2020年12月原位肝移植患者40例，根据2010年OLTHOFF等提出的EAD诊断标准，将患者分为EAD组和非EAD组。留取患者术后1、3、5、7 d胆汁，分别比较EAD组与非EAD组术后第1、3、5、7 d胆汁中各种胆汁酸的变化水平。采用ROC曲线评价胆汁中各胆汁酸水平变化对肝移植患者术后发生EAD的预测价值。结果：患者术后第1 d，EAD组测定的GDCA水平较非EAD组降低，术后第5 d，EAD组测定的GCA、GDCA水平较非EAD组升高，术后第7 d，EAD组测定的TLCA、GCDCA、GDCA水平较非EAD组升高；组间比较(P < 0.05)。根据ROC曲线提示，患者术后第7 d，胆汁中GCDCA对判断患者术后早期发生EAD的AUC是0.762，同为第7 d，胆汁中TLCA水平对患者术后早期发生EAD的AUC为0.754，术后第5 d，患者术后胆汁中GCA的水平对判断患者术后早期发生EAD的AUC为0.721。结论：留取肝移植术后患者第1、3、5、7 d胆汁，测量胆汁中各种胆汁酸的含量，肝移植术后7 d内胆汁中的GCDCA、GCA、TLCA水平会升高，三者的水平对肝移植患者术后早期发生EAD具有一定的预测价值，进而指导早期治疗。

Abstract: Objective: To observe the changes of various bile acids level in bile within 7 days after liver transplantation, and to explore the predictive value of their changes in early allograft dysfunction (EAD) after liver transplantation. Methods: In this paper, 40 patients with orthotopic liver transplantation from July 2020 to December 2020 were selected retrospectively. According to the diagnostic criteria of EAD proposed by Olthoff et al. in 2010, the patients were divided into EAD group and non-EAD group. The bile of the patients was collected on the 1st, 3rd, 5th and 7th day after operation, and the changes of various bile acids in the bile of EAD group and non-EAD group were compared on the 1st, 3rd, 5th and 7th day after operation. ROC curve was used to evaluate the predictive value of the changes of bile acid levels in bile for EAD after liver transplantation. Results: According to the data, the GDCA level measured in EAD group was lower than that in non-EAD group on the 1st day after operation, the GCA and GDCA levels measured in EAD group were higher than that in non-EAD group on the 5th day after operation, and the TLCA, GCDCA and GDCA levels measured in EAD group were higher than that in non-EAD group on the 7th day after operation; it is compared between groups (P < 0.05). According to the ROC curve, on the 7th day after operation, the AUC of GCDCA in bile for judging the early postoperative EAD is 0.762, which is the same as the 7th day, the AUC of TLCA level in bile for judging the early postoperative EAD is 0.754, and on the 5th day after operation, the AUC of GCA level in bile for judging the early postoperative EAD is 0.721. Conclusion: The bile of patients on the 1st, 3rd, 5th and 7th days after liver transplantation was taken, and the contents of various bile acids in the bile were measured. The levels of GCDCA, GCA and TLCA in the bile within 7 days after liver transplantation will increase. The levels of GCDCA, GCA and TLCA have a certain predictive value for the early occurrence of EAD in patients after liver transplantation, to guide the early treatment.

1. 引言

肝移植术(Liver transplantation)是目前世界范围内治疗各种终末期肝病的重要手术方式。由于器官移植手术的特殊性，使得越来越多的边缘供肝被应用到移植手术中。但同样地，肝移植术后受体发生早期移植物功能不全(EAD)的概率也随之增加 [1]。有研究表明，术后EAD患者具有并发症多，病死率的特点 [2]，因此发现早期诊断EAD的指标就显得尤为重要。胆汁是肝脏的重要代谢产物之一，当肝脏出现问题时，往往会从胆汁中体现出来。本文收集了本中心40例肝移植患者术后1、3、5、7 d的胆汁，观察了其中各种胆汁酸水平的变化，并探讨了GCDCA、GCA、TLCA水平变化对肝移植术后发生EAD的预测价值，通过此类研究希望对肝移植患者术后发生EAD提供一定的诊断价值。将实验研究内容汇报如下：

2. 资料与方法

2.1. 一般资料

本研究选取了2020年7月~2020年12月于我院器官移植中心接受同种异体经典原位肝移植手术患者40例，其中女16例，年龄41~66岁，平均(54.3 ± 10.2)岁，男24例，年龄34~63岁，平均(51.3 ± 14.2)岁。其中Child-Pugh分级A级8例，B级22例，C级10例。原发病为酒精性肝硬化4例，原发性肝癌13例，乙型肝炎肝硬化17例，急性肝功能衰竭1例，自身免疫肝病5例。纳入标准：① 年龄≥16岁；② 第一次接受肝移植手术；③ 术中留置“T”管；④ 术前无胆管感染、胆道手术及胆系结石等相关并发症；⑤ 术后存活3个月以上；⑥ 术后无不可控制的全身感染。以上病人及家属均已签署知情同意书。

2.2. 研究方法

2.2.1. 标本收集

根据纳入标准，留取纳入患者肝移植术后第1、3、5、7 d内每日晨起空腹胆汁及血清，抽取胆汁约10 ml，标记具体患者与时间，置于−80℃保存。3个月内分批采用液相色谱串联质谱法测定胆汁中6种胆汁酸水平，即甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨酸结合脱氧胆酸(GDCA)、牛磺酸结合脱氧胆酸(TDCA)。记录数据待用。

2.2.2. EAD判定标准及分组

收集于我中心实施同种异体肝移植手术患者术后7 d内的血清，利用生化分析仪分析血中ALT、AST、TBil、INR的结果，记录待用。目前国际上较为认可的EAD诊断标准为2010年OLTHOFF等 [3] 提出的诊断标准，按此标准，我们将随访患者分为EAD组与非EAD组。诊断标准如下：① 移植术后第7天TBil ≥ 100 mg/L (171 mmol/L)；② 术后第7天INR ≥ 1.6；③ 移植术后7 d内ALT或AST > 2000 U/L [3]。满足其中至少一条即可诊断为早期移植物功能不全。

2.3. 统计学方法

所有数据应用SPSS 22.0统计学软件进行分析，应用S-W检验对样本数据进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以x ± s表示，组间比较采用两独立样本t检验。应用ROC曲线分析胆汁中各种胆汁酸水平对EAD发生的预测价值。当P < 0.05视为具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 肝移植术后患者EAD发生情况

将患者手术结束的日期作为手术当天，随访40例于我中心实施同种异体原位肝移植手术的患者，随访时间为7 d，按照前文的标准将患者分为EAD与非EAD组。其中7例于术后随访期间发生EAD，男5例，女2例，年龄36~62岁，平均(50.2 ± 10.1)岁；原发疾病为原发性肝癌2例，乙肝肝硬化3例，酒精性肝硬化1例，自身免疫性肝病肝1例；Child-Pugh分级A级1例，B级3例，C级3例；无肝期时间47~128 (84.2 ± 37.5) min，冷缺血时间182~587 (387.5 ± 219.3) min，手术时间423~886 (616.3 ± 226.1) min。33例在随访期间未发生EAD，男19例，女14例，其年龄34~66岁，平均(46.5 ± 12.1)岁；原发疾病为乙型肝炎肝硬化14例，原发性肝癌11例，酒精性肝硬化3例，急性肝功能衰竭1例，自身免疫性肝病4例；Child-Pugh分级A级7例，B级19例，C级7例；术中无肝期时间33~89 (49.3 ± 28.7) min，冷缺血时间175~567 (364.1 ± 198.6) min，手术时间347~806 (508.8 ± 203.5) min。

3.2. EAD组与非EAD组肝移植术后胆汁中胆汁酸的水平比较

通过对比发现，术后第1 d，EAD组胆汁中GDCA水平较非EAD组降低，术后第5 d，EAD组胆汁中GCA、GDCA水平较非EAD组升高，术后第7 d，EAD组胆汁中TLCA、GCDCA、GDCA水平较非EAD组升高，组间比较P < 0.05，具有统计学差异。见表1。

Table 1. Comparison of bile acid levels in bile between the two groups on the 1st, 3rd, 5th and 7th day after liver transplantation (μg/mL, x ¯ ± s )

表1. 两组肝移植术后第1、3、5、7 d胆汁中胆汁酸水平比较(μg/mL, $\bar{x}\pm s$ )

注：与N-EAD组同时间点比较，^*P < 0.05。

3.3. 胆汁中胆汁酸对肝移植术后EAD的诊断价值

选取前文具有统计学差异的数据，应用ROC曲线分析各种胆汁酸对肝移植术后EAD发生的诊断价值。结果显示，术后第5天胆汁中GCA的AUC为0.718，特异性最高；术后第7天胆汁中TLCA的AUC为0.763，灵敏度最高；术后第7天胆汁中GCDCA的AUC为0.754。见表2。

Table 2. ROC evaluation of the predictive value of bile acids in bile for EAD after liver transplantation

表2. 胆汁中胆汁酸对肝移植术后发生EAD预测价值的ROC评估结果

4. 讨论

根据当前数据显示，世界范围内各器官移植中心早期发生EAD的概率约为五分之一到四分之一，我们对发生EAD与未发生EAD的患者进行远期随访发现，发生EAD患者在术后6个月内的病死率高达18.8%，未发生EAD患者在术后6个月内的病死率为1.8%，要远远低于EAD组。正是因为这样的原因，发现一个可以很好地预测EAD发生的指标并且提前干预EAD的发生就显得尤为重要 [4] [5] [6]。由于胆汁的分泌和组成成分反映了肝细胞和胆管细胞的功能状态，并且已被用于预测肝功能的变化和一些疾病的进展。已有研究证实，肝移植术后胆汁中胆汁酸水平的变化对缺血性胆管损伤发生具有一定的预测价值 [7]。在仪器以及测量技术不发达的时期，临床医生仅仅通过胆汁的量和胆汁的颜色来判断肝功能的好坏，近年来单纯的胆汁流速和颜色已经远远不能满足当前医疗发展的需要，而且由于其结果不能定量及时反映移植物功能的变化，越来越多的学者把关注重点放在分析胆汁中成分上，而且一些证据表明，胆汁成分可在实验和临床研究中用作监测和预测肝移植术后移植物功能变化的工具 [8] [9] [10] [11]。

我们选取了青岛大学附属医院器官移植中心进行同种异体肝移植手术，并且留有“T”管，通过留取胆汁，利用液相色谱串联质谱法测得胆汁中存在的各种胆汁酸水平变化，通过数据得出，肝移植术后7 d，EAD组的GCA、GDCA、GCDCA、TLCA水平较同时间非EAD组高，通过ROC曲线结果显示，术后第7 d胆汁中GCDCA与TLCA、术后第5 d胆汁中GCA可能是预测肝移植术后患者发生EAD的可靠指标。已有研究证明，胆汁是由肝脏细胞及胆管细胞产生的特殊物质，胆汁的主要构成为：水、蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质盐和微量元素。胆汁中约95%是水，其余5%为无机物和有机溶质。胆汁成分复杂，其中胆盐、磷脂、电解质和有机阴离子是人胆汁的主要成分 [8]。肝脏合成的胆盐占胆汁固体成分的50%~70%。一方面，胆盐是作为体内胆固醇代谢的最终产物存在，另一方面，胆盐又在细胞损伤及各类物质代谢中起到传递信号的作用。从成分上来讲，胆汁是带有毒性的液体，但在人体大的生理环境下其对肝细胞和胆管上皮的毒性作用又被顶端膜上的高胆固醇和鞘磷脂、胆盐微胶粒、胆汁水化或碱化等束缚；此外，胆囊的存在以及较为粗大的胆管中黏液形成的保护层以及胆汁的冲刷作用可降低胆汁与肝细胞和胆管上皮的毒性作用，让其毒性作用显现不出来 [12]。但当肝脏–胆道通路中断，或胆汁中的成分发生改变时，比如胆盐/胆固醇失衡等，胆汁的毒性作用就好显现出来 [13]。正是因为这样的原因，对于胆汁成分的研究就显得尤为重要。

已有研究表明，胆汁酸是一种双亲性物质，具有胶团形成和定向平衡两个特点，这让胆汁酸在一定浓度下(1~10 mmol/L)能让各种细胞的生物膜受到破坏，而肝脏本身数量最多的就是肝细胞和胆管细胞。Rolo AP在研究中发现，线粒体在细胞中起到了重要的作用，但当上述胆汁通路中断或发生异常，胆汁中成分比例失调时，胆汁就会淤积在肝内，线粒体也就成为了胆汁酸攻击的主要靶点。胆汁酸进入细胞后，抑制线粒体氧化呼吸化作用，使ATP合成减少，钙泵失活；同时，因为细胞膜对Ca²⁺的通透性增加，细胞外Ca²⁺超载，激活蛋白水解酶，引起蛋白质、DNA、RNA被分解破坏，使得细胞的功能丧失最终死亡 [14]。对于肝移植来说，缺血再灌注损伤是最常见胆损伤。当全新的肝脏恢复血流后肝、胆道中胆汁成分发生大的变化、胆汁酸比例失衡，其中疏水性胆汁酸比例升高，由于疏水性胆汁酸对肝细胞和胆道上皮的细胞膜具有强大的分解作用引起肝细胞膜破裂 [15] [16] [17]，所以我们在前文中才选择这几种胆汁酸作为研究目标。我们做此项研究的基础是，已有研究证明，将胆汁酸从体外注入老鼠肝细胞内，会造成老鼠肝细胞发生凋亡。Li等 [18] 研究证实：将GCDCA注入培养出的老鼠肝脏细胞中，分别使用不同的剂量形成对照组，结果表明，培养基中的老鼠肝脏细胞呈现出凋亡过程中不同的形态，呈现出明显的浓度依赖以及时间依赖性。Melendez HV等 [19] 通过分析胆汁中胆汁酸水平得出，其对于评估供体肝脏质量和早期移植后移植物功能状况具有潜在价值。胆汁作为肝细胞及胆管系统的重要代谢产物，可一定程度反应肝脏的合成与代谢功能，是移植术后患者肝脏功能恢复的一个重要参考指标 [20] [21]。原发性移植物功能不全包括早期移植物功能不全以及移植物原发性无功能两个阶段，EAD指发生于肝脏移植术后7天内的血清ALT、AST、TB、INR水平升高的移植术后状态，其移植物的功能不全具有可逆性特点；而PNF是移植后一段时间内存在ALT、AST迅速升高，同时伴或不伴代谢性酸中毒、凝血功能紊乱等临床症状的肝功能不全，这种功能不全的特点是不可逆 [22] [23]。所以我们希望通过这项研究可以达到从胆汁中测取数据来达到预测EAD的目的，以此来代替抽血，减少患者的痛苦。综上所述，本研究肝移植患者术后7天EAD组胆汁中GCDCA、TLCA、GDCA、GCA水平较非EAD组高，通过前文表述，胆汁中胆汁酸的升高可以破坏肝细胞以及胆管细胞的细胞膜，导致细胞的凋亡，肝功能恢复的异常，所以，胆汁中胆汁酸的升高有可能是反映早期肝功能恢复等可靠指标。通过ROC曲线分析结果，术后第5天胆汁中GCA的AUC为0.718，特异性最高；术后第7天胆汁中TLCA的AUC为0.763，灵敏度最高；术后第7天胆汁中GCDCA的AUC为0.754。因此肝移植术后胆汁中的GCDCA、TLCA、GCA水平的升高可能是预测肝移植患者术后发生EAD的可靠标志，当患者胆汁中GCDCA、TLCA、GCA水平高于最佳判定界值时，临床上应警惕EAD的发生并及早予以相关检查及治疗，达到改进患者预后状况的目的。由于本研究样本量较小，在大规模样本量的研究中是否支持本研究结论尚需要进一步研究。

致谢

感谢张斌老师对论文的指导以及更改，以及提供实验进行所需要的资金。感谢其余老师对我在临床工作中的指导以及论文书写前期工作的支持，包括分析数据，整理数据。感谢本文中引用的所有文章，感谢这些论文书写者无私的提供数据，只有站在巨人的肩膀上才能看的更远。