1. 引言
原发性肝癌目前在我国恶性肿瘤发病人数中位居4位，在我国恶性肿瘤相关死因中位居第2位，对我国人民的生命健康造成了严重危害 [1]。原发性肝癌中约90%左右为肝细胞癌，慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎感染是导致干细胞癌发生的主要原因，其余还有宿主、其他疾病和环境之间的相互作用引起 [2]。肝癌是一种发病率高并且死亡率高的恶性肿瘤，由于对其进行早期诊断较困难，大部分患者被诊断时已为晚期，导致预后肝癌患者生存低，预后极差 [3]。硫酸软骨素蛋白聚糖(Versican, VCAN)是一种大分子聚集硫酸软骨素蛋白多糖，属于lexicon家族，是一种重要的细胞外基质成分，与肿瘤的发生密切相关 [4]，在细胞粘附、增殖、迁移和血管生成中发挥着多种作用 [5]。本研究从TCGA数据库收集肝细胞癌患者VCANmRNA表达资料及临床病理数据，比较其肿瘤组织与癌旁组织中的表达情况，并进一步研究VCANmRNA表达及临床病理资料与肝细胞癌患者预后的关系。
2. 资料与方法
2.1. 数据收集
2022年2月通过TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载374例肝细胞癌患者肿瘤组织和50例癌旁组织的mRNA表达数据以及患者临床病理数据(包括生存时间、死亡状态、年龄、性别、肿瘤分级及TNM分期等)。
2.2. 分析VCAN基因在肝细胞癌及癌旁组织中的表达
应用R (v3.6.3)软件“limma”包，非参秩检验(Wilcox Test)分析肝细胞癌患者肿瘤组织和癌旁组织中VCANmRNA的差异表达。进一步对肝细胞癌患者肿瘤组织和癌旁组织进行配对差异表达分析。P < 0.05认为有统计学意义。
2.3. 分析VCAN基因与肝细胞癌患者预后关系
计算肝细胞癌患者肿瘤组织VCANmRNA表达水平均值，将高于均值的肝细胞癌患者定义为高表达组，将低于均值的肝细胞癌患者定义为低表达组。应用R(v3.6.3)软件“survival”包和“survminer”包通过Kaplan-Meier法进行生存分析，并绘制生存曲线。
2.4. 与生存相关的独立预后分析
应用R (v3.6.3)软件“survival”包进行单因素和多因素Cox分析，评估患者年龄、性别、肿瘤分级、TNM分期及VCAN基因表达量与患者预后的关系。使用“survminer”包绘制森林图。
3. 统计学方法
R (v3.6.3)软件进行统计学分析，服从正态分布的计量资料以
表示，两样本均数比较应用两独立样本t检验，多组间样本均数比较应用单因素方差分析。不服从正态分布的计数资料以M (P25, P75)表示，两组间数据比较应用wilcoxn检验，多组间数据比较应用H检，计数资料间比较应用x2检验。应用Kaplan-Meier法进行生存分析。单因素和多因素预后分析采用Cox回归模型。GSEA (v.4.1.0)软件进行KEGG信号通路富集分析。
4. 结果
4.1. VCANmRNA在肝细胞癌组织和癌旁组织中的表达差异
374例肝细胞癌组织中VCANmRNA的表达量为0.74 (2.20, 2.34)，50例癌旁组织中VCANmRNA的表达量为0.39 (0.23, 0.58)，VCAN在肝细胞癌组织中高表达，在癌旁组织中低表达(见图1)，差异有统计学意义(P < 0.05)。共筛选出50例肿瘤组织和癌旁组织均齐全的肝细胞癌患者进行配对差异表达分析(见图2)，差异有统计学意义(P < 0.05)。
Figure 1. VCAN was differentially expressed in HCC tumor tissues and adjacent tissues
图1. VCAN在肝细胞癌肿瘤组织及癌旁组织差异表达
Figure 2. VCAN was paired and differentially expressed in tumor and paracancer tissues of hepatocellular carcinoma
图2. VCAN在肝细胞癌肿瘤组织及癌旁组织配对差异表达
4.2. VCAN基因与肝细胞癌患者预后关系
从374例肝细胞癌患者中筛选出373例生存信息完整的肝细胞癌患者生存数据，以肝细胞癌患者肿瘤组织中VCANmRNA表达量的中位数8.08为临界值，将肝细胞癌患者分为高表达组(n = 187)和低表达组(n = 186)。Kaplan-Meier法生存分析显示(见图3)，高表达组中位生存时间为3.76年，低表达组中位生存时间为5.07年。高表达组5年生存率为41.1%，低表达组5年生存率为56.1%。差异有统计学意义(P = 0.049)。
Figure 3. Survival curves of patients with hepatocellular carcinoma with high VCAN expression and low VCAN expression
图3. 肝细胞癌患者VCAN高表达组与低表达组生存曲线
4.3. VCANmRNA表达量与临床病理特征的关系
从374例肝细胞癌患者中筛选出临床病理资料完整的患者共235例进行统计学分析(见表1)，VCANmRNA表达与患者年龄、组织学分级、淋巴结转移及远处转移无明显相关性(P > 0.05)，与患者性别、TNM分期及T分期有显著相关性(P < 0.05)。
Table 1. Relationship between VCAN and clinicopathological features of hepatocellular carcinoma
表1. VCAN与肝细胞癌患者临床病理特征的关系
4.4. 与生存相关的独立预后分析
在374例肝细胞癌患者中，删除临床资料有缺失的肝细胞癌患者139例，各项临床病理资料均完整的肝细胞癌患者共235例。单因素Cox分析显示TNM分期(P < 0.001)、远处转移(P < 0.001)、T分期(P = 0.023)、VCANmRNA表达量(P = 0.004)与肝细胞癌患者的生存显著相关，年龄、性别、组织学分级、淋巴结转移与肝细胞癌患者的生存无显著相关性(P > 0.05)。多因素Cox回归分析显示，患者的TNM分期(P < 0.001)、远处转移(P = 0.003)、VCANmRNA表达量(P = 0.031)是肝细胞癌患者预后的独立危险因素，肝细胞癌患者TNM分期每增加一个分期，死亡风险增加1.37 (95% CI = 1.44~2.37)倍，发生远处转移较不发生远处转移死亡风险增加1.07 (95% CI = 0.77~1.46)倍，VCANmRNA高表达较低表达死亡风险增加1.12 (95% CI = 0.91~1.36)倍(见表2)。
Table 2. Cox regression analysis of prognostic risk factors in hepatocellular carcinoma patients
表2. 肝细胞癌患者预后危险因素Cox回归分析
5. 讨论
VCAN是一种质量超过1000 kDa的大型细胞外基质蛋白聚糖。在子宫内膜癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌和胃癌等几种恶性肿瘤中的表达较正常组织显著升高，且与患者的不良预后相关 [6] [7] [8] [9]。VCAN的异常表达与肿瘤细胞增殖分化、粘附以及细胞外基质的稳态和完整性的变化有关 [10]。VCAN通过调节细胞外基质促进肿瘤生长，肿瘤组织中VCAN的表达增加可能是肿瘤血管生成和转移的必要条件 [11]。VCAN与CD44和透明质酸可以在细胞外基质中形成一种大分子复合物，介导肿瘤细胞的运动从而导致肿瘤细胞侵袭和转移 [12]。VCAN在肝细胞癌中表达及其与预后的关系目前研究较少。
在本研究中，通过对TCGA数据库数据进行分析，VCAN在肝细胞癌组织中高表达，在癌旁组织中低表达。进一步对肿瘤组织和癌旁组织表达进行配对差异分析，差异均有统计学意义(P < 0.05)。VCAN在肝细胞癌肿瘤组织中显著高于正常组织，可进一步通过检测血清中的VCAN，判断血清中VCAN是否升高，判断对肝细胞癌的早期诊断有无有意义。
高表达组中位生存时间为3.76年，低表达组中位生存时间为5.07年。高表达组5年生存率为41.1%，低表达组5年生存率为56.1%。表明VCAN对肝细胞癌患者的不良预后相关，VCAN高表达患者中位生存期更短，5年生存率降低，可为早期分析患者的预后提供依据。
通过对VCANmRNA表达量与患者临床病理特征分析发现，VCAN高表达与肝细胞癌的TNM分期(P = 0.048)及T分期(P = 0.037)呈显著相关。表明VCAN高表达与可能与患者原发肿瘤的增殖有关，可以判断原发灶的大小，可与影像学等其他辅助检查对肿瘤是否可行手术治疗提供诊断依据。
通过Cox回归分析发现，TNM分期(P < 0.001)、T分期(P = 0.003)、VCANmRNA表达量(P = 0.031)是肝细胞癌患者预后的独立危险因素。死亡风险增加1.37倍，发生远处转移较不发生远处转移死亡风险增加1.07倍VCANmRNA高表达较低表达死亡风险增加1.12倍。可以通过VCANmRNA表达量对患者的预后及早作出判断。
VCAN可能是促进肝细胞癌细胞增殖的一个关键基因，可能是肝细胞癌潜在的预后生物标志物，为进一步研究VCAN在肝细胞癌中的作用奠定了基础。本研究不足之处在于未对VCAN在肝细胞癌中的表达进行验证，可通过进一步验证研究VCAN在肝细胞癌中的表达及其与预后的关系。